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rodwell

新虫 (初入文坛)

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[求助] 【求助】PGL3-basic载体，连500bp左右的片段，菌落长得很满，却都是空载体已有1人参与

这个做了两次，第一次：质粒跟目的片段酶切都是37度过夜的，质粒也切开了（4800bp处条带），连接是4度过夜连的（所用T4的说明书上是4度）。转化amp板子之后第二天密密麻麻都是菌落，但是提出来的质粒双切之后只能看到载体条带，500bp处空空如也，但奇怪的是PCR却能P出500bp条带来。
不死心，拿去测序，果然转进去的是空质粒。
理论上感受态细胞只能接受一种质粒啊，所以又否决了重组和空载都转进去了的猜测。

第二次P完之后先拿去测序，无误，其他步骤同上，不过多连接了半天，结果还是一样，这次连PCR都没条带了。但还是能长出密密麻麻的菌落，然后提出来发现是空质粒。

排查各种情况后，俺认为双酶切按理说不应该自连这么严重啊~ 会不会是双切的时候，有一个酶没切开？但是Bgl II和Xhol I都是常用酶，还共用H-buffer，这样看来会不会是其中一个酶失活了？

带着这个猜测，我用两种酶分别单切了质粒，再加上一个未切的质粒作control，跑出来的结果是：两个酶都在4800bp处有条带，而control由于超螺旋明显跑到了前面。。。但我留意到其中Xhol I 在大于5K marker的地方，也就是更靠后的地方还有一条带，俺的问题就在这里：这是不是说吗Xhol I 有问题？是不是一部分只切开了单链？

另外如果不是酶的问题，这个过程中还会有哪些步骤会导致“克隆很多，却全是空载体”这种局面呢？跪求指导~

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