| 查看: 986 | 回复: 0 | ||
zsy0625木虫 (小有名气)
小博
|
[求助]
求教~双酶切后3000左右bp片段和pET28a载体表达载体构建~
|
|
因我自己现在做2835bp的片段和pET28a（5000bp左右）载体连接转化，一直没成功。。。向大家求教。 我用Takara公司的NdeI和NotI酶双酶切，2个酶的体系是不同的，查takara表后选了 通用体系H buffer和BSA，37度，分别对PCR回收后产物（分别添加了6个和8个保护 碱基，浓度61.7ng/ul 260/280=1.92）和pET28a载体双酶切8hr ---完了之后再跑胶，均有1条带，纯化后浓度PCR产物的为24.4ng/ul，和17.6ng/ul ---分别用载体4ul，DNA 4.5ul，用T4连接酶连接，16度1hr，之后4度过夜 ---之后再转化到Kan的板子上，神马都没长。。。 请问有做过NedI和NotI双酶切的，或其他酶切的前辈吗？ 想问下可能是哪里出了问题？是否双酶切效率不高？分别切会好些吗？还有哪些要注 意的地方呃~~(╯﹏╰)b 非常感谢！！！ |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有203人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
找到一些相关的精华帖子，希望有用哦~
为什么30度下比40度下酶的失活快
已经有19人回复
- 同源重组敲除13KB大片段
已经有8人回复
- 求助：PCR扩增片段测序结果引物中间多出150bp的片段
已经有5人回复
- 两个基因融合构建真核表达载体需要去掉信号肽吗?
已经有7人回复
- 求真菌表达载体pBARGPE1的酶切方法！！！
已经有11人回复
- 用过pET28a(+)表达载体的高人请指教
已经有31人回复
- 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
已经有52人回复
- 129bp小片段从pGEM-T上酶切回收的问题
已经有13人回复
- 【求助/交流】片段转进去，提质粒酶切发现载体小了，想不明白
已经有19人回复
- 【问题反馈】质粒双酶切切下120bp每次都看不到？
已经有21人回复
- 【分享】关于载体双酶切的一些经验
已经有19人回复
- 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因
已经有23人回复
点击这里搜索更多相关资源科研从小木虫开始，人人为我，我为人人
