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zsy0625

木虫 (小有名气)

小博

[求助] 求教~双酶切后3000左右bp片段和pET28a载体表达载体构建~

因我自己现在做2835bp的片段和pET28a（5000bp左右）载体连接转化，一直没成功。。。向大家求教。
我用Takara公司的NdeI和NotI酶双酶切，2个酶的体系是不同的，查takara表后选了
通用体系H buffer和BSA，37度，分别对PCR回收后产物（分别添加了6个和8个保护
碱基，浓度61.7ng/ul 260/280=1.92）和pET28a载体双酶切8hr
---完了之后再跑胶，均有1条带，纯化后浓度PCR产物的为24.4ng/ul，和17.6ng/ul
---分别用载体4ul，DNA 4.5ul，用T4连接酶连接，16度1hr，之后4度过夜
---之后再转化到Kan的板子上，神马都没长。。。
请问有做过NedI和NotI双酶切的，或其他酶切的前辈吗？
想问下可能是哪里出了问题？是否双酶切效率不高？分别切会好些吗？还有哪些要注
意的地方呃~~(╯﹏╰)b
非常感谢！！！
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燃烧吧，小宇宙~
1楼 2012-04-18 16:37:34
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