应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 长bp的片段的连接问题。
51/1返回列表
查看: 1462  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

leisure93

新虫 (初入文坛)

[求助] 长bp的片段的连接问题。 已有3人参与

目的基因片段长度11kb左右。为了把他扩出来 分成了三段。part-1.2.3。part-1前段加入启动子。末端加了三个酶切位点。在part-2中加了几个内含子。part-3加了个荧光蛋白。现在part1.2.3都扩出来了，也验证过了，本来是想part-1.和part-2先连接后和part3连接。可是part1.2的连接一直不成功。导致实验没法继续进行，选用的是T-1载体。其中一些假阳性 连接时长 等问题都排除过了，也换过短的质粒 一直没能连接成功。重新加酶切位点也不太可能了，求助是不是长bp的片段链接应该需要注意什么？ part1.2.3的长度大约在2700 4000 4400左右。求助啊

@biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan 发自小木虫IOS客户端
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2016-05-01 20:48:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sloop112

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
9楼2016-05-05 10:33:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你P的好长啊。。。话说，你可以试试无缝连接。。如果非要用普通的酶切连接，可以考虑试一下T4+PEG4000连接。另外，我之前做长一点的（也没你那么长）我是这么做的：片段1后面加上酶切位点A\B\C，然后片段1连接到载体上；PCR片段2的时候，就在他两边加了酶切位点A-B，然后插进去连过片段1的载体上；PCR片段C的时候同理。。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2016-05-02 11:31:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

leisure93

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-05-02 11:31:47
你P的好长啊。。。话说，你可以试试无缝连接。。如果非要用普通的酶切连接，可以考虑试一下T4+PEG4000连接。另外，我之前做长一点的（也没你那么长）我是这么做的：片段1后面加上酶切位点A\B\C，然后片段1连接到载体 ...

有人建议我试着直接往表达载体上连 不往克隆载体上连了。我还是感觉你的建议靠谱。谢谢啊

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
3楼2016-05-02 21:49:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)
如果用无缝克隆的话，的确可以直接往目的载体上连。只不过多片段的连接效率就不得而知了。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
4楼2016-05-02 22:06:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求调剂 +3 yunziaaaaa 2026-03-01 3/150 2026-03-01 21:45 by 王兆江
[考研] 0856求调剂285 +10 吕仔龙 2026-02-28 10/500 2026-03-01 21:37 by 公瑾逍遥
[考研] 274求调剂 +3 cgyzqwn 2026-03-01 6/300 2026-03-01 21:24 by cgyzqwn
[考研] 0856材料与化工，270求调剂 +3 YXCT 2026-03-01 3/150 2026-03-01 19:51 by 无懈可击111
[考研] 材料化工调剂 +10 今夏不夏 2026-03-01 11/550 2026-03-01 19:49 by 无懈可击111
[考研] 材料学硕318求调剂 +9 February_Feb 2026-03-01 11/550 2026-03-01 19:47 by 无懈可击111
[考研] 0857调剂 +3 一ll半 2026-02-28 3/150 2026-03-01 18:32 by 热情沙漠
[考研] 材料类求调剂 +10 wana_kiko 2026-02-28 11/550 2026-03-01 18:11 by 海嵙Y
[考研] 328求调剂 +3 aaadim 2026-03-01 5/250 2026-03-01 17:29 by njzyff
[考研] 281求调剂 +4 2026计算机_诚心 2026-03-01 7/350 2026-03-01 17:20 by 2026计算机_诚心
[考研] 303求调剂 +4 今夏不夏 2026-03-01 4/200 2026-03-01 14:46 by 嘟嘟小浣熊
[考研] 课题组接收材料类调剂研究生 +3 gaoxiaoniuma 2026-02-28 4/200 2026-03-01 14:30 by jjj三跨
[考研] 295复试调剂 +3 简木ChuFront 2026-03-01 3/150 2026-03-01 14:27 by zzxw520th
[考研] 317一志愿华南理工电气工程求调剂 +6 Soliloquy_Q 2026-02-28 11/550 2026-03-01 11:14 by 歌liekkas
[考博] 博士自荐 +4 kkluvs 2026-02-28 4/200 2026-03-01 10:19 by 馥安馥安
[硕博家园] 2025届双非化工硕士毕业，申博 +3 更多的是 2026-02-27 4/200 2026-03-01 10:04 by ztg729
[论文投稿] 求助coordination chemistry reviews 的写作模板 10+3 ljplijiapeng 2026-02-27 4/200 2026-03-01 09:07 by babero
[论文投稿] Optics letters投稿被拒求助 30+3 luckyry 2026-02-26 4/200 2026-03-01 09:06 by babero
[考研] 304求调剂 +3 52hz~~ 2026-02-28 5/250 2026-03-01 00:00 by 52hz~~
[考研] 085600材料工程一志愿中科大总分312求调剂 +8 吃宵夜1 2026-02-28 10/500 2026-02-28 20:27 by L135790
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭