（木虫生物专题讨论）之核酸提取纯化专题贴
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不才经过半个多月的整理，核酸提取纯化专题终于完成了。
本专题共分两篇
一为技巧篇
二为解惑篇
其中每篇分别整理成三章：
DNA，RNA（含mRNA）和质粒。
请各位多多支持！
如果你觉得你从中学到了一点东西，
就把它顶起来吧，
让更多的人从中获益~
[ Last edited by raindrop8316 on 2008-8-19 at 08:44 ]
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京公网安备 11010802022153号
第一章 DNA提取与纯化
主题16：植物线粒体DNA的提取
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=569136&fpage=206
无解答
主题17：CTAB法提DNA出现问题（碎末状沉淀）
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=578068&fpage=195
解答1：guohuayin
我觉得碎末状沉淀是你没有去除干净的蛋白质，在苯酚－氯仿重提阶段，建议不要为了获取大量的的DNA而将中间的那层吸出来，那层是蛋白质，吸取上清液的时候，在最后快要吸完的时候，最好不要继续吸出了，防止蛋白质污染。建议你用苯酚－氯仿抽提一次，再用氯仿：异戊醇抽提一次。并且用70％的酒精多洗涤几次，酒精洗涤的作用主要是去除盐分。最后酒精洗涤完后，一定要晾干后再用适量的双蒸水溶解或者TE缓冲液溶解。
解答2：沙砾
建议大家在做DNA沉淀的时候加入1/10体积的3M的醋酸钠，再加无水乙醇，沉淀效果会更好
主题18：提取DNA检测发现三条带，谁能解释?
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=584447&fpage=195
解答1：tuotuozw
材料，过程都有可能造成DNA的怪异现象出现
解答2：xuuue
可能是连同RNA一起提了出来，这很正常，你去RNA了吗？
解答3：如果泳道没有明显弥散现象，而且LZ电泳中出现的3条带中的2条挨得很进，且与第3条距离较远的话，那多数应该是xuuue所说的提取样品中混有RNA，加点RNaseA处理一下就可以了。
主题19：核酸提取求助:帮忙分析下失败原因在哪?
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=593897&fpage=188
解答1：guohuayin
抽提核酸中我的做法是
首先加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（体积比25：24：1），轻轻上下颠倒几次，混匀2分钟左右，12000rpm，离心10分钟；
然后吸取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比24:1)和上面的步骤一样，抽提一次，取上清
这两步试验可以反复三次，主要是去除蛋白质和糖类等杂质。
最后加入1/10体积的3M的醋酸钠（.PH5.3），2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。
－20度放置30分钟，室温15000rpm,离心10分钟，沉淀用70％的乙醇洗涤去除盐分，稍微干燥后，加入适量的缓冲液溶解。－20度冰箱中保存。
解答2：yangguoxing888
应该和上下颠倒的时间没关系。没准是你基因组提取后溶解，如果缓冲液多得话DNA浓度会低，这样也不一定能跑出来，至于前端的东西，没准是RNA。
解答3：tsguest
你上下颠倒混匀的时间太长了，这样容易把DNA弄断，而且如果你要是需要大片段的DNA，这样做更是不行。你如果把DNA一提出来，马上就跑，有可能就什么也跑不出来，你可以用TE溶了DNA后，在4度放置一晚，第二天再跑电泳就有可能有你提的DNA，
解答4：yzh-1999
说太剧烈导致链断裂，最后使得溶液浑浊这个说法太牵强。
我还是同意楼主说的，是消化不彻底的问题。我抽提RNA时，若样本太多，导致Trizol不够用的时候，也会出现大量的浑浊。我想可能是你没有加蛋白酶K，或量太少，导致蛋白消化不彻底，所以后续加酚不能使它沉淀分层。
冷冻后，这些悬在溶液中的蛋白析出，很正常。
所以，从消化开始，再注意点。
解答5：insect2004
你用的EB染色是不是浓度太低，或用的时间太长，把EB换成新的，另外加上MARK, 这样如果MARK跑出来而你的DNA没有跑出来，那就说明不是染色的问题，你再找别的原因，如果你不是用试剂盒提得，那你就检查一下你的关键试剂有没有问题，原因得一步步找，实验做得多了，你的经验也就多了，你再多提几次
解答6：yzh-1999
前面那些弥散条带可能是RNA，降解的DNA等等。
建议重新配制和准备试剂， 消化时间长一些，比如甚至可以将正在消化的样品在37度的摇床上过夜
解答6：insect2004
把样品保存在－80度，保存1－2年不会有问题，如果你们实验室没有超低温冰箱，那你就把样品保存在－20度，保存一两个月应该没有问题。关键试剂重新配，也不费多少事
主题20：求助DNA提取！
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=597267&fpage=187
解答1：guohuayin
首先你先检测一下你的有没有提取出DNA，这个问题你可以先测定吸光度，同时也可以测定一下纯度，确定提取出来DNA后，再进行PCR扩增目的基因。扩增的时间一定要加入对照，看看PCR体系有没有问题。
解答2：自然风
你的试剂盒加酶之后处理的时间是不是比较短？因为试剂盒与常规提DNA的方法的差别之一就是试剂盒酶处理的时间要短得多，可能有这方面的原因。
另外，你的试剂盒是否是用柱子回收的？可以试试用常规的酚氯仿代替柱子回收看看，因为对于大片段的DNA，用柱子回收效果稍差。
还有，是不是因为样品的量比较少，才导致检测不清楚？
解答3：bioartist
提取总DNA，破胞很关键！！
上海生工的试剂盒都是用于一般菌体的提取，对胞外多糖多的细菌和革兰氏阳性菌，一般都比较难提取！
另外，有时候，试剂盒提取的DNA量非常少，电泳检测不到，但可以用于PCR扩增目的基因，其他操作不宜！
其实许多传统的方法提取效果都很好的！！
解答4：xiaopu_yin
你抽提的是细菌、放线菌还是酵母？我用的是博达泰克的试剂盒，一般用液氮或在－80度反复冻融几次就会有较好的效果。总之破胞很重要，而菌体量过多有时效果反而不好，
第一章 DNA提取与纯化
主题21：关于细菌DNA提取
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=613415&fpage=176
解答1：自然风
芽孢杆菌是阳性菌，溶菌酶终浓度一般需要3mg/ml，可能是你的对照菌株是阴性菌，所以效果较好。酶一般需要保存在—20度（还要避免反复冻融），4度保存很容易失活。
解答2：lingyu20071001
有的阳性菌较难破壁，可以把多加点溶菌酶，对基因组影响应该并不太大，
解答3：goses
G+细胞壁都狂厚，代表菌就是金葡了，不过提DNA一般用不上溶菌酶。提质粒是必须用的，我加的5mg/ml，37度应该40-60m，每隔10分钟混悬一次。
溶菌酶最好是粉末存-20，现用现配，溶液存4度不能超过1周
主题22：洗涤DNA有什么技巧么?
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=605008&fpage=176
解答1：wujiequn
个人感觉先把70%的乙醇轻轻倒掉，但不要把EP管倒置于吸水纸上，剩余的一点溶液用小枪吸掉比较好，这时候自然晾干也比较快。
电吹风干燥一般没什么影响，有时候吹得太干了可能会把DNA也吹跑了。
解答2：xuuue
根据外观可以初步判断提取质量，好的DNA 沉淀为白色，干后透明；如果干后仍呈白色，常因蛋白较多；若呈黄至棕色，则是有多酚类杂质；呈胶冻状则含有多糖。
解答3：telomerase
乙醇是直接倒掉（绝大部分）,然后再离心然后用小枪吸净残留乙醇
这样的话很快就干了 ，没吹过电风扇
解答4：wujiequn
不要用吸水纸，太脏了，会污染。直接用小枪头吸出剩余的乙醇。沉淀贴壁牢不牢无所谓，吸的时候注意不要把沉淀吸出来就是了。
解答5：glucidum
一般情况下，用70%乙醇洗的时候DNA是会松动的，能松动是好事。去乙醇的方法像3楼说的那样就很好。至于吹干方面，一般基因组DNA不建议用吹风机吹干，一个是怕吹掉，另外一个原因是干燥过快会引起基因组DNA断裂。如果是 质粒提取的话，那吹干是没问题的。如果超净台比较空闲的话，吸掉乙醇以后放超净台吹干其实也蛮快的。
解答6：angelina-wl
先用70%乙醇洗，12000rpm,2min（可使DNA重新聚在管底）,重复一次，用无水乙醇洗一次（DNA干燥快一些），放在工作台上15~30Min风干即可。
主题23：基因组DNA检测问题
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=623067&fpage=170
解答1：niure
电泳有没看到比较亮的条带啊，有时候分光光度计结果也不要太相信，跑个PCR看下
解答2：xiaopu_yin
分光光度计检测时受洗脱所用的溶液有关，你可以试一下试剂盒提供的洗脱液和双蒸水，误差还是比较大的
解答3：yifanyifan
很多其他成分如糖类,蛋白也影响测定结果, 如果你有对照,比如公司合成的引物,可以测定一下,找找原因.不过大于2.0,理论上应该是RNA污染,你加些RNase 处理样品看看.
解答4：reasonspare
不知道楼主用的什么溶解的DNA，如果是试剂盒的，一半为Tris什么的，这时候浓度比较大一些。
如果你知道你用的试剂盒是什么东东，就更好了，
因为酚也影响，胍也影响。
还有，不要单单看比值，，
OD230 和OD260， Od280的实际值 也不要太低
主题24：放线菌基因组DNA的提取方法
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=628829&fpage=162
(1〕取3ml培养过夜的细菌培养物离心0.5分钟，收集菌体；
〔2〕用无菌水洗涤菌体，12000rpm，离心1分钟；
〔3〕沉淀物加入567 u l TE（pH 8.0）缓冲液，重悬菌体，加入30 u l 溶菌酶（50mg/ml）混匀，于37℃温育1小时；
〔4〕加入30 u l 10%的SDS和3 u l （20mg/ml）的蛋白酶K，混匀，于55℃温育1小时；
〔5〕加入100 u l 5M Nacl, 充分混匀，再加入80 u l CTAB/Nacl 溶液，混匀，于65℃温育10min；
〔6〕 加入2ul RNA酶，37℃温浴15分钟；
〔7〕加入等体积的酚/氯仿，混匀，抽提；
〔8〕加入等体积的氯仿，抽提一次；
〔9〕 加入1/10体积的3mol/L NaAc 溶液，2倍体积的无水乙醇，混匀，放置－20℃冰箱30分钟；
〔10〕 轻轻混合直到DNA沉淀下来，离心；
〔11〕 用70%乙醇洗涤沉淀1次，晾干；
〔12〕将已干的DNA溶于40 u l 超纯水中，-20℃保存。
解答1：edragonfly
推荐看一本《链霉菌遗传操作手册》
建议修改：
（2）用25mM的EDTA洗
（3）温育时间延长或增加溶菌酶量（貌似你的菌体不少啊）
如果多糖不是很厉害 第5步可以不要
整体步骤应该是没有问题的。
到（9）应该能看到明显的絮状沉淀 没有的话 基本就没提出来了
解答2：liudanlucky
加入溶菌酶温浴直到呈均匀粘稠状。纯度要求不是太高的话可以省去5，6步，4步中加入适量EDTA.第9步中直接用预冷的无水乙醇沉淀也可以。应该没问题，A260/A280可达到1.8-2.0
主题25：猪肝的DNA提取
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=638159&fpage=162
无解答
第一章 DNA提取与纯化
主题26：提植物DNA时出现的问题（上清液墨绿色）
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=639732&fpage=156
解答1：wenyangapple
我们实验室的protocol是这样的，你参考一下，看看能不能有所启发。
200微升CTAB研磨；加300微升CTAB; 65度水浴20分钟；加氯仿-异戊醇（24:1）震荡，离心，取上清；加等体积异丙醇，离心弃上清；洗涤，溶解。
我估计是你用的提取液不好了。
解答2：wdf1980122
转速不够
解答3：wdgsmv58
离心时间和转速不够
解答4：henghengyouyou
深绿色的溶液是对的，你还要其他几步在去除蛋白等
解答5：如来神掌
提取液加少了
解答6： glenn_007
加入提取液后，再用氯仿-异戊醇抽提2～3次去除蛋白干扰。每次缓慢颠转50次左右，然后离心，就可以得到上清液了。
主题27：细菌基因组DNA为什么提不出来？
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=627321&fpage=155
解答1：reasonspare
如果出现多糖等物质需要洗涤几次，推荐TES， 其他可以用生理盐水或者灭菌去离子水，
1 ok
应该
2 加入TE后加入 lysome 37 度 1 h 或 更长时间，或者反复冻融（-20- 20度）超声波也可以考虑）总之先打破细胞壁。
加如 pro K 1h 去蛋白
3 加入 ＳＤＳ 后重复振荡，37 度 30min 或更长，
其他 不变，
解答2：hudong
请你检查一下你用的所有试剂，试剂出问题的话也是没有 DNA。如果是一点DNA都没有的话，那很可能是试剂出问题了。建议重换试剂试试，或同时用其它方法试试。还有，你是小提，不用摇那么多的菌，用试管摇5ml就够了。
解答3：fengkai6200
我是从肌肉组织提的dna。我加的SDS的量比你大，100ul10%SDS。在55度反应2小时。当然因为肌肉组织不好裂解，所以比提菌的DNA多加了SDS，提高了反应温度。
我觉得你可以适当的改变一下条件，加大点SDS的量，或延长反应的时间。
我这方法提取的DNA质量很好的，没有降解，做pcr的效果也很好的
解答4：li3564617
dna沉淀使用肉眼看不见的，你不妨提完后跑个电泳看看，上述方法应该没问题，我用上海生工的试剂盒用的方法根你的差不多，效果也不错。
我们用无水乙醇沉淀，加入等体积的无水乙醇，-20摄氏度放置10分钟，然后4度离心
解答5： edragonfly
ctab和DNA在低浓度Na离子时会发生结合 具体浓度是多少不记得了 自己查一下
解答6：genehsy
第六步中可以加1/10体积的3mol/L的醋酸钠促进DNA沉淀。
另外还有一种简单的方法你可以试一试，收集菌体用TE悬浮后直接用等体积的苯酚：氯仿（1：1）混合液直接抽提，离心取上清液，醇沉即可。
解答7：wbz66
DNA提取之后是看不见的,能看见的是一些蛋白质的杂质,建议跑个电泳看一下最好
解答8：bbzhangzhang
一个超级高手经常提醒我，抽提，一定首先把菌或细胞器充分裂解！
我个人强烈建议你在适当的裂解步骤加上剧烈涡旋2min，其他步骤暂时不变，相信会有作用。另外我查了，“CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可以从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA ”。你看盐离子浓度是否合乎CTAB结合与分离核酸的要求，再做调整
主题28：花生DNA提取出现的问题
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=645796&fpage=153
解答1：deepbluewater
你换SDS法试试？或者用液氮法？其实CTAB法除多糖的效果较好，但是对样品要做些前处理，我作的样品在CTAB之前需要用乙醇溶液浸泡，你可以试试对样品进行前处理（例如乙醇溶液浸泡，PVP浸泡【但是PVP浸泡容易导致DNA浓度过低，琼脂糖凝胶检测时条带不明显】）
解答2：glenn_007
离心后，取上清电泳试试？我觉得你应该是提取到了
SDS法适合蛋白含量较高的样品，CTAB适合多糖成分含量较高的样品。视具体情况而定
主题29：细菌基因组DNA抽提的问题（多条带）
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=662031&fpage=139
无解答
主题30：氧颗粒污泥总DNA提取（附电泳图）
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=675053&fpage=138
解答1：xiaoyu1014126
你把土样都放冰箱里，有些能产芽孢的菌都产生芽孢，这对实验啊有影响啊？
解答2：lxlxyc
CTAB/NaCL在温度低的情况下结晶，放在65摄氏度水浴，直到结晶彻底溶解。水浴时不停摇动。
第一章 DNA提取与纯化
主题31： DNA提取电泳图分析（拖尾，点样孔亮）
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=695090&fpage=127
解答1：marongfeng
点样孔处比较亮，可能就是多糖比较多。拖尾的话可能是轻微的讲解吧。至于做杂交就不知道可不可以了。如果做测序肯定要纯化。
解答2：fw1980613
点样孔的是杂质，提取用的样品最好用鲜样。
最好别用做杂交。
杂交选择质量好的DNA。
解答3：JayKing999
点样孔有亮度应该是实验操作的问题。电泳时尽量小心的将将枪头深入点样孔后再打出，DNA放置时间长有降解对杂交应该没太大的问题。我们实验室有用了半年的DNA做PCR、杂交都没问题。
主题32：DNA提取问题（酚仿抽提后离心总是出现混浊，离不下去）
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=399218&fpage=127
解答1：浪迹天涯
可能是你的样品混有其他杂质。
解答2：eleenjane
试剂的问题？
解答3：heda0691
把转速提高些试试（10000-12000rpm，10min），好象有点效果。
解答4：suneternal
我觉得可能是中间乳化剂的问题，另外可能是温度比较低。
我也经常提出DNA，是从动物组织中。开始的时候也出过一些问题，但我尽量能把每一步做到标准化，现在是基本没出过问题了。
我觉得你加入样品多少（磨完后在加CTAB前称一下样品），加多少CTAB，再加多少酚氯仿，最好都有一个比例。这样做虽然有点繁琐，但我觉得中间出了问题也好知道在哪里。
解答5：yaoqian622
在材料研磨时要注意材料量，尽量作到研磨成粉状，用1.5ml离心管装时液氮粉的量不要超过0.5ml的线，建议多次离心抽提，适量提高转速，但也不要过高。
主题33：大曲中微生物DNA的提取方法
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=888791&fpage=23
无解答
主题34：关于HBV DNA提取
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=829660&fpage=53
解答1：wjswj
经典的核酸提取方法通常是加去污剂（SDS等）裂解细胞，经蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。（全部解答见链接）。
主题35：请教热裂解法提取细胞DNA（在50个细胞中得到基因组DNA）
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=845366&fpage=45
无解答
第二章 RNA提取与纯化
主题1：RNA电泳只有5S
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=910041&fpage=2
解答1：jasco
降解
解答2：raindrop8316
降解了；时间跑长了（5s和18s都跑出去了，就剩28s了）
主题2：哪位用TRIzol法提过樱花的总RNA?
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=481566&fpage=259
解答1：johnsooh
如果你是平行作的烟草、番茄可以提的出来，而樱花、樱桃、桃子提不出来，那么可能要求更改针对特殊植物样本的提取方法了，可是，如果不是平行操作，平行电泳检测，则不能说明方法有问题，建议重新作
解答2：telomerase
从富含多糖的植物组织中提取和纯化RNA （方法详见链接 8楼）
主题3：SDS/酚法提植物RNA 为什么沉淀不是白色
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=595187&fpage=188
解答1：reasonspare
没有关系， 你比如说提取的是植物叶片或茎， 无论你研磨多小， 都会有些色素干扰，所以 操作的质量好不好，关键看结果，如果结果不好： 如果是降解了，那就从防止RNase 入手，如果提到的量少，或者有DNA 或蛋白的污染， 就要从操作上改进，具体怎么改进，我觉得这个方法很成熟，只有工作做到位，肯定能出来。。。。。。
解答2：guohuayin
你提取的RNA中有色素，也就是说你在吸取上清的时候，尽量少吸些，宁缺勿滥，只要提取的RNA质量好，肯定能反转录出来，我试过，我提取的RNA也含有色素，但是RNA质量好，也反转录出来了
主题4：RNA提取OD260/280>4.0?
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=504545&fpage=246
解答1：轻5飞扬
有没可能是你提的不错,但跑电泳时上样太高,以致看到拖影,至于OD值么,呵呵,我觉得一般来讲都不是很准,当然4可能确实有些太过了,呵呵,你做什么呀,如果要求一严格的话,直接RT一下,有你要的东西不就OK了么
解答2：yang22181
拖影应该是降解的结果吧！?
OD值的比值肯定错误！检查你的分光光度计（找个已知浓度溶液）和比色杯（应用配套石英杯）！
解答3：lanyu270
降解了，肯定>2.2为降解。
解答4：fruit
有不同的溶液OD值是不同的，用DEPC水可能会偏低，有tris可能会偏高，用蒸馏水试试。
主题5：花的RNA提取问题
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=518971&fpage=208
解答1：puma2003
是不是花中的本来含量就少啊
解答2：wpszy2000
短链的RNA用这种方法不行的，要用超离心法！
解答3：hn8265
花的含水量如果高的话，在提取的时候很易被降解。你可以试试少放些样品，或多加些Tirzol.
解答4：鲸鱼001
试试其他方法，用LiCL沉淀法看看，能不能行，还有你的花最好不要带露水。
氯化锂沉淀法很容易可以搜到。
第二章 RNA提取与纯化
主题6：请教RNA extraction的几个问题
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=574242&fpage=203
无解答
主题7：用保存一年的组织样提取RNA可以吗？
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=613045&fpage=170
解答1：xyzwujun
RNA特别容易降解，没有特别的保护剂是难以长久保存的
解答2：telomerase
因该没问题，我以前在实验室协助师兄提过液氮里的乳鼠等组织，没有问题！！
我还提过-80里保存的组织，也没有问题的。就在液氮里研磨，然后再提，问题不大！
解答3：傻子
应该没问题，我做的叶片材料在-50度放着快6个月了也没事，一直放在液氮中没冻化过的话应该没事。但是在取样时，要注意。取出来的样品在磨样前要置于液氮中，不能化掉，而且加液氮碾磨
解答4：kklkimo
1. 液態氮保存的檢體在液態氮(-196 C; 較危險)或乾冰(-45C; 較安全) 的保護下以不鏽鋼杵研磨反而容易將組織磨碎(超低溫碎裂)，接著再以Tri-reagent or Trizol 在4C下或插在冰上?氐啄ゼ殹�
2. 檢體的長期儲存現在有RNA Later (Qiagene or Sigma) reagnet 可以用。添加適量reagent ?肀ＷoRNA不被降解效果還不錯，且只需保存在-80C即可
主题8：果实RNA的提取
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=668040&fpage=142
解答1：hyf9901
去参照一下07年朱英国教授的论文，做的是玉米胚乳RNA提取
解答2：xiding
Wan CY, Wilkins TA (1994) A modified hot borate method significantly enhances the yield of high-quality RNA from cotton (Gossypium hirsutum L.). Anal Biochem. 223: 7–12
主题9：23S rRNA提取方法
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=726982&fpage=104
无解答
主题10：植物RNA提取
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=920650&fpage=1
解答1：知秋
invitrogen公司经典试剂盒trizol,效果很好，我们的样品里多酚含量也很高，不过效果还可以，野外的当然取材后马上放入液氮罐最好，提时注意低温，有两点最重要，一是磨样时样品分装的管事先放入液氮浸一下，还有磨成的样分装和加trizol要快，不能等样品变湿了，再就是加氯仿离心后转上清时一定不要吸到中间白色东西，该舍就舍吧，再就是溶解rna时枪头吹打要小心不要直接吹在沉淀上。其实RNA也没那么娇贵了，前面几步用普通离心管就行，后面离开trizol保护后再转到depc处理管，祝你好运。
第二章 RNA提取与纯化
主题11：提RNA后测得OD值比为2.3,电泳什么都没有
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=759097&fpage=95
解答1：轻5飞扬
如果提出来了,那么无论你如何电泳,只要没有上RNase消化,至失会有一条非常亮的5S表明的你RNA降解了,如果你什么也没看到,那可能你什么也没提出来,不知道沉淀完后能看到EP管中有白色沉淀么?
主题12：mRNA 分离纯化后，电泳是2条带，没有smear.
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=776594&fpage=81
无解答
主题13：RNA提取（在涡旋器上涡旋会不会震断RNA）
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=860874&fpage=38
解答1：raindrop8316
我们原来用LiCl法（不是试剂盒)提真菌的RNA，也是要求加完裂解液后在涡旋器上涡旋，提出来的效果也蛮好的，断了没有我就不知道了，我们只是用来做简单的RT-PCR，能做出来就是了
第三章 质粒提取与纯化
主题1：提取质粒时为什么总是有总DNA？
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=617672&fpage=175
解答1：jiasanlin
如果是碱裂解发提取质粒的时候，一般裂解时间长的化就会混入genome DNA,一般情况下加入溶液2后只要看到菌液清亮，就要马上加入溶液3 终止。变清亮的时间跟收集菌体的量和溶液2的用量有关，分子克隆手册上的不要超过5分钟，只是一个大概的时间。
解答2：guohuayin
前三步越快越好，并且动作一定要轻柔，不然会造成大量的基因组DNA断裂。
解答3：angelina-wl
加溶液2后动作要轻柔,也要快.不然会打断总DNA,在电泳检测时在靠近口的地方就能看见.
解答4： 随风而过
实在没办法，你就跑个电泳切胶回收质粒，质粒的分子量你应该知道吧。提取质粒的时候加容易2的时候要轻柔，最好只是轻轻的颠倒几次就行，千万不要用涡旋混匀器，否则动作大了就会打断总DNA的
主题2：如何抽提较大的质粒
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=400060&fpage=160
解答1：wwwkkk83
超纯度大型质粒的抽提试剂盒
专门用于纯化小于250kb的BAC、PAC、P1或粘粒DNA，可彻底去除基因组DNA的污染。
货名 规格 货号 价格
QIAGEN large-Construct Kit 10perps 12462 4338
解答2：轻5飞扬
质粒大,所以拷贝会少自然提出的也少,用碱法提应该可以,多集些菌,然后蛋白那部多抽些应该会好些,最后消化时间也略长些吧,2h可以试一下
解答3： 随风而逝
减法抽提的量确实比较大，我们实验室都是用这种方法抽30000左右的大质粒的。你的量比较少可能有以下几个问题：
1. 大质粒不能保菌，每次都要转化质粒，调斑。剩余的部分菌液，赶在第二天前大扩。千分之一加菌液，青霉素千分之一稍小些。
2. 摇菌时间保证十二小时，时间稍长，大质粒会迅速消失
主题3:如果提取这种菌的质粒和RNA (洋葱伯克氏菌，G- 细菌)
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=725282&fpage=115
无解答
主题4：质粒提取结果两条带是为什么（疑为基因组DNA）
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=767741&fpage=87
解答1：lauren180
延长碱变性时间
解答2：yuanzhiqin.119
试试在提取液上想想办法，本质跟延长时间是一样的
解答3：linfeng196
我觉得有三种可能，一是细菌基因组的污染，解决的办法是加入溶液II的时候操作要轻柔，不要剧烈，还要控制时间，二可能是你的质粒的状态不好，如果你的质粒状态好的话，大多数应该以超螺旋形式存在，而你的都是线性的，没有超螺旋的，所以那个可能是开环状态的质粒，我觉得第二种可能性更大些 。第三种可能是已经发生了质粒的整合
主题5：质粒电泳求助（没有条带)
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=780570&fpage=79
解答1：xxh8372
是不是上样有些少啊？
解答2： 十比
应该以电泳为准，分光光度计不准的。可能质粒提得有问题
主题5：质粒提不出来？ （保存的菌种在AMP中可见长，但质粒提不出）
链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=876309&fpage=30
解答1：jasco
菌液划线，挑单菌落，再液体培养重新抽质粒
解答2：duanyongzhong
可能是你的菌种已经被污染了，在这种情况下，菌体内含有amp抗性基因，但并没有质粒的存在，所以你提不到质粒，我考虑是这种原因。检验你的受体菌是否被污染。
[ Last edited by raindrop8316 on 2008-8-19 at 08:47 ]