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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 提取质粒出现杂条带。
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朱振刚

新虫 (小有名气)

[交流] 提取质粒出现杂条带。

大家好。我将我的目的片段3000bp 连入我的载体7000bp。连接方式是单酶切连接。载体经过去磷酸化处理。提取质粒后跑出来的电泳图如图所示。
提取质粒之前已经做过菌落PCR。所以这次是将菌落PCR得到的阳性菌进行抽提质粒。发现质粒的位置五花八门。有的比对照质粒还要小。有的还有很多条带。 不知道怎么回事。
第一道为7000bp对照质粒。

提取质粒出现杂条带。
捕获.PNG
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越努力 越幸运
1楼 2015-07-04 20:26:53
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b6122

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的感受态是不是被污染了？
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6楼2015-07-07 03:48:06
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ppppppppp

新虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
朱振刚: 金币+1 2015-07-05 17:04:27
第一，质粒电泳出现三条带，很正常，最快的那条是质粒超螺旋，中间的是质粒本身，最慢的是质粒的复制中间体。
第二，目的质粒应该是10000bp，我看第三泳道可以考虑测序下。
第三，不知道你菌落pcr用的是什么引物。单酶切一般引物是要用质粒上的一条和目的基因上的一条引物进行pcr反应的。
第四，酶切之后可能马上又自己连回去了，或者去磷酸化不完全，都是载体自连的可能原因。
第五，很前面的那条带不知道是啥质粒，会不会你的3000bp中有复制子，3000bp的自连了呢。或者，你的酶加多了，信号活性，乱切。
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初来乍到，请多指教
2楼2015-07-05 15:10:23
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ppppppppp

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
还有可能是里边有双质粒。
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初来乍到，请多指教
3楼2015-07-05 15:12:39
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朱振刚

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ppppppppp at 2015-07-05 05:10:23
第一，质粒电泳出现三条带，很正常，最快的那条是质粒超螺旋，中间的是质粒本身，最慢的是质粒的复制中间体。
第二，目的质粒应该是10000bp，我看第三泳道可以考虑测序下。
第三，不知道你菌落pcr用的是什么引物。 ...

谢谢你的解答。很详细。
我菌落PCR两条引物分别是载体上的和目的片段上的。为了排除目的片段连反的可能性，所以我有针对性的选择了引物。
还有。我这个载体是用来做表达的。我担心会不会有连正的载体和连反的载体一同进入菌体进行表达呢？
我已经将1,2,3,4号质粒送出去测序了。现在等待测序结果呢。
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越努力 越幸运
4楼2015-07-05 17:08:04
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