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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增基因出现问题怎么办
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八瓣格桑cav

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR扩增基因出现问题怎么办 已有5人参与

同样的引物刚开始用着还好，扩增出的片段经琼脂糖凝胶电泳检测后条带单一且较亮。但是后来扩增出的片段经琼脂糖凝胶电泳检测后条带变暗，再后来直接出现拖尾的情况。不知是什么原因，请大神搭救。。
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1楼 2015-06-09 14:17:01
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该是试剂的原因，引物、模板、酶一个个分析，重新稀释引物，重提模板，换新酶。
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2楼2015-06-09 14:22:41
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八瓣格桑cav

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-06-09 14:22:41
应该是试剂的原因，引物、模板、酶一个个分析，重新稀释引物，重提模板，换新酶。

都做过啦，还是不行啊。
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3楼2015-06-11 22:06:42
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
拖尾？点样孔亮不亮？LZ用的酶是否是mix?能不能把跑的图贴几张出来？

[ 发自小木虫客户端 ]
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大家相互帮助哈
4楼2015-06-12 01:12:23
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xiao_monv

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
电泳缓冲液配新的
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5楼2015-06-12 10:04:11
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xiao_monv

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

还有拖带可能是模板降解 或者抽提的时候洗涤盐类没洗干净
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6楼2015-06-12 10:05:00
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

PCR拖尾的可能原因：
1.酶量过多
2.退火温度偏低
3. Buffer不合适
4.dNTP、Mg 2+浓度偏高
5.循环次数过多
建议从以下几方面优化：
1.减少DNA聚合酶用量
2.适当提高退火温度
3.适当降低dNTP和镁离子的浓度
4.减少循环次数
以上四条是从网上摘的。
因为楼主已经用电泳检测过了被扩增的DNA，带单一且明亮，怎么会是模板不纯或者发生了降解哪！？
但是我还要补充：如果不是上面的原因，很可能是引物的专一性太差，所以扩增片段不均一；另外还有操作过程发生了污染，PCR反应体系中的实际的扩增模板不唯一。
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7楼2015-06-12 16:15:26
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calorimetry

铜虫 (正式写手)
这样一个简单明确的问题，也知道含糊其辞吗？另外，楼主明确否定掉的原因，为什还要再三讨论？
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8楼2015-06-12 16:16:58
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自由SKY

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

第一你得PCR条件有没有改变，第二你的胶是不是没制好。
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9楼2015-06-12 18:20:20
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福建啊萧

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1.没把buffer，引物，酶等完全溶解好再配MIX，2.把全部都换掉，重新做，里面肯定有管污染了3.胶新配4.减少跑胶的量，浓度太高会拖带5.如果还不行，把引物，模板量减半试下

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2015-06-14 00:44:52
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