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八瓣格桑cav

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR扩增基因出现问题怎么办 已有5人参与

同样的引物刚开始用着还好,扩增出的片段经琼脂糖凝胶电泳检测后条带单一且较亮。但是后来扩增出的片段经琼脂糖凝胶电泳检测后条带变暗,再后来直接出现拖尾的情况。不知是什么原因,请大神搭救。。
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

PCR拖尾的可能原因:
1.酶量过多
2.退火温度偏低
3. Buffer不合适
4.dNTP、Mg 2+浓度偏高
5.循环次数过多
建议从以下几方面优化:
1.减少DNA聚合酶用量
2.适当提高退火温度
3.适当降低dNTP和镁离子的浓度
4.减少循环次数
以上四条是从网上摘的。
因为楼主已经用电泳检测过了被扩增的DNA,带单一且明亮,怎么会是模板不纯或者发生了降解哪!?
但是我还要补充:如果不是上面的原因,很可能是引物的专一性太差,所以扩增片段不均一;另外还有操作过程发生了污染,PCR反应体系中的实际的扩增模板不唯一。
7楼2015-06-12 16:15:26
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
应该是试剂的原因,引物、模板、酶一个个分析,重新稀释引物,重提模板,换新酶。
2楼2015-06-09 14:22:41
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八瓣格桑cav

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-06-09 14:22:41
应该是试剂的原因,引物、模板、酶一个个分析,重新稀释引物,重提模板,换新酶。

都做过啦,还是不行啊。
3楼2015-06-11 22:06:42
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
拖尾?点样孔亮不亮?LZ用的酶是否是mix?能不能把跑的图贴几张出来?

[ 发自小木虫客户端 ]
大家相互帮助哈
4楼2015-06-12 01:12:23
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