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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 简并引物PCR扩增问题
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tmoonday

金虫 (小有名气)

[求助] 简并引物PCR扩增问题 已有5人参与

各位虫友好，敝人这段时间一直苦于基因克隆问题上，希望高人能够不吝赐教。请问各位大仙一般用简并引物扩增基因时的反应程序是什么啊，50ul体系各个成分的量一般怎么组合啊？谢谢啦
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等一份缘分
1楼 2014-02-18 10:46:51
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tmoonday: 金币+2, ★有帮助, 试试啊 2014-02-18 13:24:56
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-18 18:00:28
10X LA Buffer:5uL
dNTP:4uL
上游:2uL
下游:2uL
模板：1uL
LA Taq：0.5uL
加水至50uL

1、94℃ 2min
2、94℃ 30sec
3、54℃ 30sec    此温度根据自己的引物进行调节
4、72℃ 2min     延伸时间根据扩增的片段大小进行调节   
5、72℃ 10min
2-4共35 cycles
赞一下(2人) 回复此楼
植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
2楼2014-02-18 13:13:51
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YL1255968814
3楼2014-02-18 14:00:25
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hellolin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-02-18 17:59:56
体系和普通PCR差不多，关键是退火温度，我们一般用40-45℃
赞一下(2人) 回复此楼
scienceguy
4楼2014-02-18 14:03:17
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forrestgump

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-18 18:00:02
简并引物的退火温度最好用TD-PCR，再搞巢shiPCR
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5楼2014-02-18 14:16:47
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-18 18:00:15
你想用哪个酶进行扩增？？如果选定了那个酶，那么你买酶的时候就会带着说明书的，按上面的做。
扩增的时候我一般加甜菜碱（50ul的体系里面加5ul5M的甜菜碱），效果比较好。不加也可以。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2014-02-18 16:59:06
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dameng198400

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hellolin at 2014-02-18 14:03:17
体系和普通PCR差不多，关键是退火温度，我们一般用40-45℃

温度那么低的话，会不会二聚体太多？
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7楼2014-08-29 09:59:15
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爱上鱼……

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我按平常的pcr条件就做出来了，结果没啥区别哦。
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懒病又犯了……
8楼2014-08-29 11:07:17
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hellolin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by dameng198400 at 2014-08-29 09:59:15
温度那么低的话，会不会二聚体太多？...

不会的，扩出来没问题
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scienceguy
9楼2014-08-30 21:24:51
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