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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教直接测序和克隆测序的问题
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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教直接测序和克隆测序的问题 已有3人参与

之前已经求助过一次了。做cDNA全长验证，引物设计的都可以，最后跑胶的结果也还行，就是直接测序的结果很纠结。我的cDNA全长是1200bp左右，直接测序得到的差不多是920bp，而且在MEGA软件中作变异位点分析是发现有35个变异位点。。。我之前用的是rtaq酶，请问是换一种酶做还是直接克隆测序。谢谢。
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1楼 2015-04-29 15:07:55
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-05-03 14:20:53
rTaq的保证性不好，建议使用高保真扩增酶。测序，建议使用克隆测序，多送两个克隆。
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2楼2015-04-29 15:48:28
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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-04-29 15:48:28
rTaq的保证性不好，建议使用高保真扩增酶。测序，建议使用克隆测序，多送两个克隆。

谢谢。我再问一下老板，重新换个酶试试

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3楼2015-04-30 12:11:34
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王冠傑

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

直接测序结果怎么会相差这么多，前后50bp不算，引物结合位置不算也用该有1000bp以上啊。不麻烦的话你可以做克隆测序试试，要是怕麻烦建议你重新来一遍吧。这个结果听着不太靠谱。。。。。
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4楼2015-05-10 16:17:03
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nemo88

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
5楼2015-05-10 19:15:51
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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by nemo88 at 2015-05-10 19:15:51
建议克隆测序，你这个情况不要直接测序

直接测序用的是你的引物，起始及结尾30bp之内可信度很差，要使用这个结果比较需要删除掉。。。
如果你是用的一个方向的引物单向测序，那基本800bp以后的就别考虑了  具体 ...

做了一次直接测序，我扩的有1500bp左右，测序结果只有950bp，现在送生工克隆测序了，等结果出来了我在上来请教。谢谢

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6楼2015-05-11 12:23:38
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nemo88

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
7楼2015-05-11 14:04:51
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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by nemo88 at 2015-05-11 14:04:51
还是搞不清楚你的测序结果哈  到底是单向测序还是全部测通呢  如果单向 950bp是正常的...

双向的。我拼接的结果就这么多

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8楼2015-05-11 14:35:45
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