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添翼如虎

新虫 (小有名气)

[交流] 克隆测序结果为什么都是载体呢? 已有6人参与

我回收的DNA片段扩增后条带很亮位置也对,然后做连接和转化,挑取单菌落液体培养,然后用之前扩增目标片段的引物重新扩增菌液,检测后发现也是目标片段,但是测序回来的结果在blast对比都是载体的序列?各位高手请指教
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
测序后序列长度对不对啊
2楼2012-12-02 11:31:03
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Trista`

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
是不是 拿错菌了?
结交优秀的人
3楼2012-12-02 11:57:59
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drizzling

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
laozuzunzhe: 金币+2, good 2012-12-03 10:54:10
1. 如果是PCR产物直接连接(T-载体),会存在部分空载体自身环化。
2. 单菌落液体培养前有没有经过分纯划线培养?如果没有经过反复分纯,可能是连接转化时残存的PCR产物,导致扩增阳性。根据楼主的描述产物很亮,这种可能性很大。
3.避免这种现象的方法:PCR进行筛选时,用一条你的特异引物加上一条载体上的引物(T7或SP6)搭配进行扩增。
4楼2012-12-02 16:10:06
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seasonin

银虫 (小有名气)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
laozuzunzhe: 金币+1, glyz 2012-12-03 10:59:39
那是因为测序结果的一部分是你的载体序列,我们之所以要把片段连接到载体上送测序,第一是因为连上载体利于复制,第二是因为测序结果开始的部分不准确,所以连到载体上,以保证你的序列的准确性
5楼2012-12-03 10:00:39
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m606

铜虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
酶切位点 选取出问题了
6楼2012-12-05 11:24:26
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m606

铜虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
说错了 是你的引物序列与载体上的同源性太强了
7楼2012-12-05 11:26:52
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diandong

禁虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
本帖内容被屏蔽

8楼2012-12-05 12:18:16
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drizzling

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by diandong at 2012-12-05 12:18:16
你好。请问下,一般选择是上游引物还是下游引物?...

可以固定上游引物或下游引物,分别与载体引物配对,也可以相反
9楼2012-12-05 17:37:07
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