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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 克隆测序结果为什么都是载体呢？
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添翼如虎

新虫 (小有名气)

[交流] 克隆测序结果为什么都是载体呢？已有6人参与

我回收的ＤＮＡ片段扩增后条带很亮位置也对，然后做连接和转化，挑取单菌落液体培养，然后用之前扩增目标片段的引物重新扩增菌液，检测后发现也是目标片段，但是测序回来的结果在ｂｌａｓｔ对比都是载体的序列？各位高手请指教
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1楼2012-12-02 11:09:42
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)
★
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测序后序列长度对不对啊
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2楼2012-12-02 11:31:03
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Trista`

铜虫 (小有名气)
★
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是不是 拿错菌了？
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结交优秀的人
3楼2012-12-02 11:57:59
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drizzling

金虫 (小有名气)
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laozuzunzhe: 金币+2, good 2012-12-03 10:54:10
1. 如果是PCR产物直接连接（T-载体），会存在部分空载体自身环化。
2. 单菌落液体培养前有没有经过分纯划线培养？如果没有经过反复分纯，可能是连接转化时残存的PCR产物，导致扩增阳性。根据楼主的描述产物很亮，这种可能性很大。
3.避免这种现象的方法：PCR进行筛选时，用一条你的特异引物加上一条载体上的引物（T7或SP6）搭配进行扩增。
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4楼2012-12-02 16:10:06
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seasonin

银虫 (小有名气)
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laozuzunzhe: 金币+1, glyz 2012-12-03 10:59:39
那是因为测序结果的一部分是你的载体序列，我们之所以要把片段连接到载体上送测序，第一是因为连上载体利于复制，第二是因为测序结果开始的部分不准确，所以连到载体上，以保证你的序列的准确性
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5楼2012-12-03 10:00:39
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m606

铜虫 (正式写手)
★
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酶切位点 选取出问题了
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6楼2012-12-05 11:24:26
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m606

铜虫 (正式写手)
★
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说错了 是你的引物序列与载体上的同源性太强了
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7楼2012-12-05 11:26:52
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diandong

禁虫 (著名写手)
★
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本帖内容被屏蔽
8楼2012-12-05 12:18:16
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drizzling

金虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
8楼: Originally posted by diandong at 2012-12-05 12:18:16
你好。请问下，一般选择是上游引物还是下游引物？...

可以固定上游引物或下游引物，分别与载体引物配对，也可以相反
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9楼2012-12-05 17:37:07
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