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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教直接测序和克隆测序的问题 已有3人参与

之前已经求助过一次了。做cDNA全长验证,引物设计的都可以,最后跑胶的结果也还行,就是直接测序的结果很纠结。我的cDNA全长是1200bp左右,直接测序得到的差不多是920bp,而且在MEGA软件中作变异位点分析是发现有35个变异位点。。。我之前用的是rtaq酶,请问是换一种酶做还是直接克隆测序。谢谢。
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-05-03 14:20:53
rTaq的保证性不好,建议使用高保真扩增酶。测序,建议使用克隆测序,多送两个克隆。
2楼2015-04-29 15:48:28
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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-04-29 15:48:28
rTaq的保证性不好,建议使用高保真扩增酶。测序,建议使用克隆测序,多送两个克隆。

谢谢。我再问一下老板,重新换个酶试试

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2015-04-30 12:11:34
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王冠傑

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

直接测序结果怎么会相差这么多,前后50bp不算,引物结合位置不算也用该有1000bp以上啊。不麻烦的话你可以做克隆测序试试,要是怕麻烦建议你重新来一遍吧。这个结果听着不太靠谱。。。。。
4楼2015-05-10 16:17:03
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nemo88

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

5楼2015-05-10 19:15:51
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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by nemo88 at 2015-05-10 19:15:51
建议克隆测序,你这个情况不要直接测序

直接测序用的是你的引物,起始及结尾30bp之内可信度很差,要使用这个结果比较需要删除掉。。。
如果你是用的一个方向的引物单向测序,那基本800bp以后的就别考虑了  具体 ...

做了一次直接测序,我扩的有1500bp左右,测序结果只有950bp,现在送生工克隆测序了,等结果出来了我在上来请教。谢谢

[ 发自小木虫客户端 ]
6楼2015-05-11 12:23:38
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nemo88

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

7楼2015-05-11 14:04:51
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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by nemo88 at 2015-05-11 14:04:51
还是搞不清楚你的测序结果哈  到底是单向测序还是全部测通呢  如果单向 950bp是正常的...

双向的。我拼接的结果就这么多

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2015-05-11 14:35:45
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