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永恒_99

金虫 (正式写手)

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专业: 病原细菌与放线菌生物学

[求助] 启动子与质粒正反向连接已有5人参与

本人想将5个基因的启动子分别与特定的质粒正、反向连接，如何可以简便的操作。先合成带有已单酶切后序列的启动子片段，正反向连接质粒。如何实现保证正反向都能连接，而且怎么验证呢。
假如这种方法行不通，那么另一种基本的方法，就是设计带有双酶切位点的引物，PCR扩增片段，双酶切连接。反方向是交换上下游引物酶切位点。请问这么设想对吗。谢谢。本人初涉微生物领域。

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1楼2015-04-11 21:57:39

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condy

新虫 (小有名气)

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专业: 微生物遗传育种学

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
永恒_99: 金币+1, ★有帮助 2015-04-13 08:39:01

引用回帖:

6楼: Originally posted by 永恒_99 at 2015-04-12 21:13:35
好的，谢谢。
看到相关文献报道，pDN19lac这种穿梭质粒与启动子片段连接后，可否直接倒入目的菌株中，为什么要先导入大肠杆菌这一步呢。而且在这之前，为什么还要将启动子片段与另一种质粒连接，导入大肠杆菌中呢 ...

一般克隆一个DNA片段不能保证PCR过程中其不会发生突变，通过目的片段与另一个质粒（如T载体）连接转化大肠肝菌让连接产物扩增，方便用载体上的通用引物进行目的片段的测序。这样就可以知道扩增的片段是否突变了。接下来才可以将目的片段连入其它的质粒分析其启动子活性。之后的操作都是酶切、连接，不会使目的片段突变。