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永恒_99

金虫 (正式写手)

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[求助] 启动子与质粒正反向连接已有5人参与

本人想将5个基因的启动子分别与特定的质粒正、反向连接，如何可以简便的操作。先合成带有已单酶切后序列的启动子片段，正反向连接质粒。如何实现保证正反向都能连接，而且怎么验证呢。
假如这种方法行不通，那么另一种基本的方法，就是设计带有双酶切位点的引物，PCR扩增片段，双酶切连接。反方向是交换上下游引物酶切位点。请问这么设想对吗。谢谢。本人初涉微生物领域。

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1楼2015-04-11 21:57:39

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永恒_99

金虫 (正式写手)

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引用回帖:

5楼: Originally posted by 王丹2013 at 2015-04-12 17:27:58
楼主的两种设想都可以实现，验证的话在质粒上另找一个酶切位点，对于第一种方法，用单酶切所用的酶和质粒上的这个酶切位点进行双酶切，根据切下来的产物大小来判断，前提是质粒序列已知；第二种方法验证方法类似，也 ...

好的，谢谢。
看到相关文献报道，pDN19lac这种穿梭质粒与启动子片段连接后，可否直接倒入目的菌株中，为什么要先导入大肠杆菌这一步呢。而且在这之前，为什么还要将启动子片段与另一种质粒连接，导入大肠杆菌中呢。望赐教。