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将两个基因串联到启动子下面，两个基因都能表达么？
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| 想请问各位大侠，如果我将两个基因GFP、neo基因串联到A3启动子下游，两个基因都是完整的阅读框，中间用内切酶Not I酶切连接。下游再加上加尾信号和反向重复序列。这样子GFP和neo两个基因都能表达么？ |
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 分子问题及解决方案汇总 | 细胞生物学实验经验 |
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lanhaizhixin
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同一个启动子的情况下，多个基因串联起来，说是可以，不过越是下游的基因表达越是微弱。 这里是赖良学通讯的一篇文章，作者制作了一种带有红绿黄蓝四种荧光的转基因猪。 ****直接将四种荧光基因表达载体同时转入宿主（也就是猪体细胞，比如成纤维细胞）。这种最直接、最简单的方案可以使得四种载体同时存在宿主內，理论上就可以实现多基因的共表达。但是作者提到其数据（未发表）显示，转基因的效率很低、而细胞筛选之后这些基因的表达水平也很低。所以最直接、最简单的方案并不能成立。 ****将这四个基因串联在一个表达载体上。这样类似限制性内切酶酶切——连接酶连接的方案，实现基因组装的实验，本科生都可以做。因为理论上这些个基因存在与同一个表达载体上，所以基因拷贝的数量是一致的、基因启动表达的时间是同步的，所以每个基因串联之后，理论上这多个基因共表达时可以实现等水平的表达。但是实际总是不像理论上如此一帆风顺，实际情况是下游的基因表达水平总是比上游的基因表达水平要低很多。 ****如此违背理论预测的结果实际上才是可以解释的。这一切的故事发生在翻译水平。当所有基因“无缝”串联连接时，核糖体一边拖着越来越长的肽链，一边继续沿着mRNA翻译。问题就在于其亲和力可能不足以维持如此长片段转录本的翻译，在翻译到一半时（比如在黄色荧光蛋白处）就脱离转录本了。于是造成上游基因表达的机会更多，而下游基因表达的机会更少。从而下游基因表达量不如上游基因表达量。 ****当然，解决这个问题的办法可以是每一个基因的上游单独设置一个RBS。具体来说，基因工程里大量使用的方案是用IRES（病毒在宿主翻译起始序列）。这样每一个基因在招募核糖体时都是独立的。这样各个基因表达的机会不受彼此限制。不过新的问题是：他们各自表达机会不是相同的。独立发生四次翻译事件表达四种基因。这意味着这个方案并不是完美方案，每个基因表达量很有可能不是一致的，不能实现同水平表达。虽然四种蛋白表达可能都很高，但是四种的表达量却不同。甚至都不可预测哪个表达多、哪个表达少。不可控的事情，显然不是完美的。 ****毕竟如果只是给猪上四种颜色，这项技术确实足够了。这项技术真正的科学意义在于可以为癌细胞定位等提供方案。可以用四种颜色来标记不同细胞，四种颜色能相同深度是理想的，方便标记和比较。所以如果诸君有在做基因共表达的，不妨可以考虑这个策略。 为了克服这个问题，新的方案诞生了，就是基于2A短肽的方案。作者将多个基因用一种称为2A的间隔序列串联起来，是每个基因表达都高校表达。这段序列是19个氨基酸。简单来说，它的功能就是剪切相邻肽链。如此一来，核糖体翻译完毕上游红色荧光蛋白，就可以脱去红色蛋白，跳到下游绿色蛋白的翻译过程。一次翻译事件的发生，可以实现了四个基因的等量共表达。 [1]上文地址http://www.plosone.org/article/i ... ournal.pone.0063241 [2]Mizuguchi H, Xu Z, Ishii-Watabe A, Uchida E, Hayakawa T (2000) IRES-dependent second gene expression is significantly lower than cap-dependent first gene expression in a bicistronic vector. Mol Ther 1: 376–382. [3]Zhou Y, Aran J, Gottesman MM, Pastan I (1998) Co-expression of human adenosine deaminase and multidrug resistance using a bicistronic retroviral vector. Hum Gene Ther 9: 287–293. |
48楼2013-07-06 20:58:04
31楼2012-12-20 22:10:11
【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
清风寨: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-12-21 08:30:39
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| 如果是质粒上的，只能用同一个启动子，又不想做成融合蛋白的话，可以用IRES或2A连接两个蛋白，这样可以表达两个蛋白，但是用IRES，前一个蛋白一定要带终止密码；如果用2A，前一个蛋白一定不能带终止密码，另外，IRES序列有点大，大概500+bp，但用它两个蛋白的表达量差不多，2A相对较小，但是后一个蛋白的表达量比不上前一个，具体差多少不好说。如果做成融合蛋白，可能问题也不大，如果觉得NotI作为linker短的话，可以加上flag，或His6，都比较有利于蛋白自身折叠。希望有帮助！ |
32楼2012-12-20 22:51:35
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清风寨: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-12-23 15:45:35
清风寨: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-12-23 15:45:35
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一个Promoter可以控制多个蛋白的转录。但控制多长要看Promoter的强度，在PKS的基 因中，一个promoter控制多个蛋白的表达是很正常。 stop codon是在翻译这个环节来决定蛋白的终止跟promoter控制的转录是分子生物学中两个不同的事件。promoter负责DNA变成mRNA的，如果如够强的promoter,使连续3-5个基因发生转录是一点问题都没有的。 比如 pET28, 我们在NdeI和XhoI位点克隆一个基因，在基因的后面引入一个SpeI位点，将另一个已 经在pET28的基因用XbaI和SpeI切下来克隆到前一个克隆的SpeI位点上。两个基因先后promoter T7控制。但是每个基因有自己的RBS(ribosome binding site）和stop Codon,在翻译的时候核糖体会识别这一头一尾两个位点，表达出两个蛋白。强度肯定是越排在后面的越弱，但是每个蛋白翻译的速率和半衰期不一样，表达出的量也不同。 |
46楼2012-12-23 09:33:27
2楼2012-12-20 08:53:54
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52楼2014-10-10 10:14:10
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