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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 将两个基因串联到启动子下面，两个基因都能表达么？
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hzjlan

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
35楼: Originally posted by 清风寨 at 2012-12-21 08:33:48
2A是两个A碱基么？...

不是啊2A也是一段DNA序列，好像有F2A、T2A等，aagattgtggcccctgtgaagcagaccctgaactttgacctgctgaagctggctggcgatgtggagtccaaccctggcccc这是一段F2A的序列，在细胞内翻译出的蛋白会在2A的地方被切开，所以就得到两个不同的蛋白了
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清风寨
41楼2012-12-21 20:47:12
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清风寨

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
41楼: Originally posted by hzjlan at 2012-12-21 20:47:12
不是啊2A也是一段DNA序列，好像有F2A、T2A等，aagattgtggcccctgtgaagcagaccctgaactttgacctgctgaagctggctggcgatgtggagtccaaccctggcccc这是一段F2A的序列，在细胞内翻译出的蛋白会在2A的地方被切开，所以就得到两个不 ...

thanks
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冷风过心变热
42楼2012-12-21 21:49:47
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清风寨

银虫 (小有名气)
引用回帖:
41楼: Originally posted by hzjlan at 2012-12-21 20:47:12
不是啊2A也是一段DNA序列，好像有F2A、T2A等，aagattgtggcccctgtgaagcagaccctgaactttgacctgctgaagctggctggcgatgtggagtccaaccctggcccc这是一段F2A的序列，在细胞内翻译出的蛋白会在2A的地方被切开，所以就得到两个不 ...

那你知道如果一个基因没有终止子会影响这个基因的表达么
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冷风过心变热
43楼2012-12-21 21:51:24
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hzjlan

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
43楼: Originally posted by 清风寨 at 2012-12-21 21:51:24
那你知道如果一个基因没有终止子会影响这个基因的表达么...

如果用2A，前面的蛋白肯定不能带终止子，直接转译出一个融合蛋白，然后细胞内的机制会自动在2A的地方把融合蛋白切开，但两个蛋白的氨基酸序列没有变化，可能会带有一点2A的残基，但那个不影响；如果是IRES，前一个蛋白要带终止子，这样前一个蛋白才可以得到，不然只能得到一个融合蛋白跟后一个蛋白。
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44楼2012-12-22 00:30:59
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该都可以表达，但是可能会影响二者的高级结构，他们可能不能正常折叠
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45楼2012-12-22 10:57:23
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
清风寨: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-12-23 15:45:35
一个Promoter可以控制多个蛋白的转录。但控制多长要看Promoter的强度，在PKS的基
因中，一个promoter控制多个蛋白的表达是很正常。
stop codon是在翻译这个环节来决定蛋白的终止跟promoter控制的转录是分子生物学中两个不同的事件。promoter负责DNA变成mRNA的，如果如够强的promoter,使连续3-5个基因发生转录是一点问题都没有的。
比如 pET28,
我们在NdeI和XhoI位点克隆一个基因，在基因的后面引入一个SpeI位点，将另一个已
经在pET28的基因用XbaI和SpeI切下来克隆到前一个克隆的SpeI位点上。两个基因先后promoter T7控制。但是每个基因有自己的RBS(ribosome binding site）和stop Codon,在翻译的时候核糖体会识别这一头一尾两个位点，表达出两个蛋白。强度肯定是越排在后面的越弱，但是每个蛋白翻译的速率和半衰期不一样，表达出的量也不同。
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修身、齐家、治国、平天下
46楼2012-12-23 09:33:27
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ghqiu2005

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

在设计表达载体的时候，必须注意， 不可改变第二个基因的读码框，否则，表达出来的就不是原来的蛋白质了。
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47楼2012-12-23 10:05:05
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lanhaizhixin

木虫 (著名写手)
同一个启动子的情况下，多个基因串联起来，说是可以，不过越是下游的基因表达越是微弱。
这里是赖良学通讯的一篇文章，作者制作了一种带有红绿黄蓝四种荧光的转基因猪。

****直接将四种荧光基因表达载体同时转入宿主（也就是猪体细胞，比如成纤维细胞）。这种最直接、最简单的方案可以使得四种载体同时存在宿主內，理论上就可以实现多基因的共表达。但是作者提到其数据（未发表）显示，转基因的效率很低、而细胞筛选之后这些基因的表达水平也很低。所以最直接、最简单的方案并不能成立。

****将这四个基因串联在一个表达载体上。这样类似限制性内切酶酶切——连接酶连接的方案，实现基因组装的实验，本科生都可以做。因为理论上这些个基因存在与同一个表达载体上，所以基因拷贝的数量是一致的、基因启动表达的时间是同步的，所以每个基因串联之后，理论上这多个基因共表达时可以实现等水平的表达。但是实际总是不像理论上如此一帆风顺，实际情况是下游的基因表达水平总是比上游的基因表达水平要低很多。

****如此违背理论预测的结果实际上才是可以解释的。这一切的故事发生在翻译水平。当所有基因“无缝”串联连接时，核糖体一边拖着越来越长的肽链，一边继续沿着mRNA翻译。问题就在于其亲和力可能不足以维持如此长片段转录本的翻译，在翻译到一半时（比如在黄色荧光蛋白处）就脱离转录本了。于是造成上游基因表达的机会更多，而下游基因表达的机会更少。从而下游基因表达量不如上游基因表达量。
****当然，解决这个问题的办法可以是每一个基因的上游单独设置一个RBS。具体来说，基因工程里大量使用的方案是用IRES（病毒在宿主翻译起始序列）。这样每一个基因在招募核糖体时都是独立的。这样各个基因表达的机会不受彼此限制。不过新的问题是：他们各自表达机会不是相同的。独立发生四次翻译事件表达四种基因。这意味着这个方案并不是完美方案，每个基因表达量很有可能不是一致的，不能实现同水平表达。虽然四种蛋白表达可能都很高，但是四种的表达量却不同。甚至都不可预测哪个表达多、哪个表达少。不可控的事情，显然不是完美的。
****毕竟如果只是给猪上四种颜色，这项技术确实足够了。这项技术真正的科学意义在于可以为癌细胞定位等提供方案。可以用四种颜色来标记不同细胞，四种颜色能相同深度是理想的，方便标记和比较。所以如果诸君有在做基因共表达的，不妨可以考虑这个策略。

为了克服这个问题，新的方案诞生了，就是基于2A短肽的方案。作者将多个基因用一种称为2A的间隔序列串联起来，是每个基因表达都高校表达。这段序列是19个氨基酸。简单来说，它的功能就是剪切相邻肽链。如此一来，核糖体翻译完毕上游红色荧光蛋白，就可以脱去红色蛋白，跳到下游绿色蛋白的翻译过程。一次翻译事件的发生，可以实现了四个基因的等量共表达。

[1]上文地址http://www.plosone.org/article/i ... ournal.pone.0063241
[2]Mizuguchi H, Xu Z, Ishii-Watabe A, Uchida E, Hayakawa T (2000) IRES-dependent second gene expression is significantly lower than cap-dependent first
gene expression in a bicistronic vector. Mol Ther 1: 376–382.
[3]Zhou Y, Aran J, Gottesman MM, Pastan I (1998) Co-expression of human
adenosine deaminase and multidrug resistance using a bicistronic retroviral
vector. Hum Gene Ther 9: 287–293.
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48楼2013-07-06 20:58:04
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
目前一种常用的方法是利用荧光来侦测已经接受DNA的细胞。通常将欲表达的基因克隆到含有绿色荧光蛋白的基因的载体上，接受此载体而且表达出绿色荧光蛋白的基因的细胞，在荧光显微镜下呈绿色。若欲表达的基因与绿色荧光蛋白的基因融合，而且由同一个启动子进行转录，制造出的mRNA会含有两个基因的序列，当翻译第一个基因而碰到终止密码子时，核糖体会从mRNA上掉下来，造成第二个基因无法表达。解决这个问题的方法是，在两个基因间加入一个内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)序列，让第二个基因可由内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)序列处进行翻译，如此两个基因就可以同时被翻译，制造出不同的蛋白质。
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49楼2013-07-06 22:47:27
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xissy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
48楼: Originally posted by lanhaizhixin at 2013-07-06 20:58:04
同一个启动子的情况下，多个基因串联起来，说是可以，不过越是下游的基因表达越是微弱。
这里是赖良学通讯的一篇文章，作者制作了一种带有红绿黄蓝四种荧光的转基因猪。

****直接将四种荧光基因表达载体同时转入 ...

请问一下，您这里介绍的2A序列是针对真核的吗？因为作者是在猪里表达的。
在原核中有很多一个启动子串联2个目的基因，每个目的基因前面都有RBS的情况。
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50楼2014-10-09 16:11:12
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