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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 启动子与质粒正反向连接
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永恒_99

金虫 (正式写手)

[求助] 启动子与质粒正反向连接已有5人参与

本人想将5个基因的启动子分别与特定的质粒正、反向连接，如何可以简便的操作。先合成带有已单酶切后序列的启动子片段，正反向连接质粒。如何实现保证正反向都能连接，而且怎么验证呢。
假如这种方法行不通，那么另一种基本的方法，就是设计带有双酶切位点的引物，PCR扩增片段，双酶切连接。反方向是交换上下游引物酶切位点。请问这么设想对吗。谢谢。本人初涉微生物领域。
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1楼2015-04-11 21:57:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

condy

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
永恒_99: 金币+1, ★有帮助 2015-04-13 08:39:01
引用回帖:
6楼: Originally posted by 永恒_99 at 2015-04-12 21:13:35
好的，谢谢。
看到相关文献报道，pDN19lac这种穿梭质粒与启动子片段连接后，可否直接倒入目的菌株中，为什么要先导入大肠杆菌这一步呢。而且在这之前，为什么还要将启动子片段与另一种质粒连接，导入大肠杆菌中呢 ...

一般克隆一个DNA片段不能保证PCR过程中其不会发生突变，通过目的片段与另一个质粒（如T载体）连接转化大肠肝菌让连接产物扩增，方便用载体上的通用引物进行目的片段的测序。这样就可以知道扩增的片段是否突变了。接下来才可以将目的片段连入其它的质粒分析其启动子活性。之后的操作都是酶切、连接，不会使目的片段突变。
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7楼2015-04-12 21:51:49
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)

【答案】应助回帖

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★
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永恒_99: 金币+1, ★有帮助 2015-04-12 14:51:11
无缝克隆试剂，一步搞定，妥妥的

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2015-04-12 08:33:37
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东走西步

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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永恒_99: 金币+1, ★有帮助 2015-04-12 14:51:22
可以尝试融合PCR的方法，应该比酶切酶连快一点。具体方法参照张一恒的simple cloning
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3楼2015-04-12 11:00:08
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王丹2013

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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永恒_99: 金币+1, ★有帮助 2015-04-12 21:13:38
楼主的两种设想都可以实现，验证的话在质粒上另找一个酶切位点，对于第一种方法，用单酶切所用的酶和质粒上的这个酶切位点进行双酶切，根据切下来的产物大小来判断，前提是质粒序列已知；第二种方法验证方法类似，也是通过引入质粒上的另外一个酶切位点进行双酶切验证。
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5楼2015-04-12 17:27:58
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SAM001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
哪有那么麻烦，质粒用双酶切以后。
片段用带着酶切位点的引物pcr就可以。
最后用T4连接

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9楼2015-04-13 09:10:54
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王丹2013

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
永恒_99: 金币+1, ★有帮助 2015-04-13 16:09:08
引用回帖:
6楼: Originally posted by 永恒_99 at 2015-04-12 21:13:35
好的，谢谢。
看到相关文献报道，pDN19lac这种穿梭质粒与启动子片段连接后，可否直接倒入目的菌株中，为什么要先导入大肠杆菌这一步呢。而且在这之前，为什么还要将启动子片段与另一种质粒连接，导入大肠杆菌中呢 ...

你首先要保证载体构建成功了才能往目的菌株中转啊，酶切以后的片段再做连接还是会有一些空质粒的，所以要先在大肠杆菌中验证，同时这一步也可以使质粒拷贝数增加。
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10楼2015-04-13 10:48:30
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普通回帖

永恒_99

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 东走西步 at 2015-04-12 11:00:08
可以尝试融合PCR的方法，应该比酶切酶连快一点。具体方法参照张一恒的simple cloning

你好，非常感谢，从哪里能下载到张一恒的simple cloning，谢谢。
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4楼2015-04-12 14:49:32
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永恒_99

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 王丹2013 at 2015-04-12 17:27:58
楼主的两种设想都可以实现，验证的话在质粒上另找一个酶切位点，对于第一种方法，用单酶切所用的酶和质粒上的这个酶切位点进行双酶切，根据切下来的产物大小来判断，前提是质粒序列已知；第二种方法验证方法类似，也 ...

好的，谢谢。
看到相关文献报道，pDN19lac这种穿梭质粒与启动子片段连接后，可否直接倒入目的菌株中，为什么要先导入大肠杆菌这一步呢。而且在这之前，为什么还要将启动子片段与另一种质粒连接，导入大肠杆菌中呢。望赐教。
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6楼2015-04-12 21:13:35
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永恒_99

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by condy at 2015-04-12 21:51:49
一般克隆一个DNA片段不能保证PCR过程中其不会发生突变，通过目的片段与另一个质粒（如T载体）连接转化大肠肝菌让连接产物扩增，方便用载体上的通用引物进行目的片段的测序。这样就可以知道扩增的片段是否突变了。接 ...

假如DNA片段合成呢，可以直接省去第一个质粒，与最后一个质粒连接，转化大肠，再转化到目的菌株中吗？顺便问一下，启动子片段多大比较合适，你知道合成基因多少钱吗。谢谢。
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8楼2015-04-13 08:43:56
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