24小时热门版块排行榜    

查看: 3307  |  回复: 10

永恒_99

金虫 (正式写手)

[求助] 启动子与质粒正反向连接 已有5人参与

本人想将5个基因的启动子分别与特定的质粒正、反向连接,如何可以简便的操作。先合成带有已单酶切后序列的启动子片段,正反向连接质粒。如何实现保证正反向都能连接,而且怎么验证呢。
假如这种方法行不通,那么另一种基本的方法,就是设计带有双酶切位点的引物,PCR扩增片段,双酶切连接。反方向是交换上下游引物酶切位点。请问这么设想对吗。谢谢。本人初涉微生物领域。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

condy

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
永恒_99: 金币+1, 有帮助 2015-04-13 08:39:01
引用回帖:
6楼: Originally posted by 永恒_99 at 2015-04-12 21:13:35
好的,谢谢。
看到相关文献报道,pDN19lac这种穿梭质粒与启动子片段连接后,可否直接倒入目的菌株中,为什么要先导入大肠杆菌这一步呢。而且在这之前,为什么还要将启动子片段与另一种质粒连接,导入大肠杆菌中呢 ...

一般克隆一个DNA片段不能保证PCR过程中其不会发生突变,通过目的片段与另一个质粒(如T载体)连接转化大肠肝菌让连接产物扩增,方便用载体上的通用引物进行目的片段的测序。这样就可以知道扩增的片段是否突变了。接下来才可以将目的片段连入其它的质粒分析其启动子活性。之后的操作都是酶切、连接,不会使目的片段突变。
7楼2015-04-12 21:51:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

biosci

捐助贵宾 (知名作家)


【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容

感谢参与,应助指数 +1
永恒_99: 金币+1, 有帮助 2015-04-12 14:51:11
无缝克隆试剂,一步搞定,妥妥的

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2015-04-12 08:33:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

东走西步

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
永恒_99: 金币+1, 有帮助 2015-04-12 14:51:22
可以尝试融合PCR的方法,应该比酶切酶连快一点。具体方法参照张一恒的simple cloning
3楼2015-04-12 11:00:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王丹2013

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
永恒_99: 金币+1, 有帮助 2015-04-12 21:13:38
楼主的两种设想都可以实现,验证的话在质粒上另找一个酶切位点,对于第一种方法,用单酶切所用的酶和质粒上的这个酶切位点进行双酶切,根据切下来的产物大小来判断,前提是质粒序列已知;第二种方法验证方法类似,也是通过引入质粒上的另外一个酶切位点进行双酶切验证。
5楼2015-04-12 17:27:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

SAM001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
哪有那么麻烦,质粒用双酶切以后。
片段用带着酶切位点的引物pcr就可以。
最后用T4连接

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2015-04-13 09:10:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王丹2013

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


永恒_99: 金币+1, 有帮助 2015-04-13 16:09:08
引用回帖:
6楼: Originally posted by 永恒_99 at 2015-04-12 21:13:35
好的,谢谢。
看到相关文献报道,pDN19lac这种穿梭质粒与启动子片段连接后,可否直接倒入目的菌株中,为什么要先导入大肠杆菌这一步呢。而且在这之前,为什么还要将启动子片段与另一种质粒连接,导入大肠杆菌中呢 ...

你首先要保证载体构建成功了才能往目的菌株中转啊,酶切以后的片段再做连接还是会有一些空质粒的,所以要先在大肠杆菌中验证,同时这一步也可以使质粒拷贝数增加。
10楼2015-04-13 10:48:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

永恒_99

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 东走西步 at 2015-04-12 11:00:08
可以尝试融合PCR的方法,应该比酶切酶连快一点。具体方法参照张一恒的simple cloning

你好,非常感谢,从哪里能下载到张一恒的simple cloning,谢谢。
4楼2015-04-12 14:49:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

永恒_99

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 王丹2013 at 2015-04-12 17:27:58
楼主的两种设想都可以实现,验证的话在质粒上另找一个酶切位点,对于第一种方法,用单酶切所用的酶和质粒上的这个酶切位点进行双酶切,根据切下来的产物大小来判断,前提是质粒序列已知;第二种方法验证方法类似,也 ...

好的,谢谢。
看到相关文献报道,pDN19lac这种穿梭质粒与启动子片段连接后,可否直接倒入目的菌株中,为什么要先导入大肠杆菌这一步呢。而且在这之前,为什么还要将启动子片段与另一种质粒连接,导入大肠杆菌中呢。望赐教。
6楼2015-04-12 21:13:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

永恒_99

金虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by condy at 2015-04-12 21:51:49
一般克隆一个DNA片段不能保证PCR过程中其不会发生突变,通过目的片段与另一个质粒(如T载体)连接转化大肠肝菌让连接产物扩增,方便用载体上的通用引物进行目的片段的测序。这样就可以知道扩增的片段是否突变了。接 ...

假如DNA片段合成呢,可以直接省去第一个质粒,与最后一个质粒连接,转化大肠,再转化到目的菌株中吗?顺便问一下,启动子片段多大比较合适,你知道合成基因多少钱吗。谢谢。
8楼2015-04-13 08:43:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 永恒_99 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的? +15 爱看书的可乐 2026-08-26 17/850 2026-08-26 21:41 by xxniao123
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 +4 晴天加油 2026-08-26 5/250 2026-08-26 21:27 by 木风9012
[基金申请] 我不理解! +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +7 process2012 2026-08-23 10/500 2026-08-26 19:23 by hmhminy
[基金申请] 系统查不到 +10 董八千 2026-08-26 10/500 2026-08-26 16:30 by Equinoxhua
[基金申请] 怎么查啊 +5 huang1991js 2026-08-26 5/250 2026-08-26 16:09 by Equinoxhua
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +26 yaoyewhu2008 2026-08-20 28/1400 2026-08-26 13:49 by zzuzxg
[基金申请] 哪位高人中了,把查询到的截图贴出来让我看看,让我长长见识 +4 yuleib84 2026-08-26 5/250 2026-08-26 13:40 by yuleib84
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国际合作可查了,中了面上 +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +4 叶九微 2026-08-26 4/200 2026-08-26 10:52 by xiacongxu
[基金申请] 今天务委会开完了,明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 国合现在查不到了吗? +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候,我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 明天应该可查了!? +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 今日不放榜?网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +17 医学老男孩 2026-08-20 22/1100 2026-08-25 15:36 by 医学老男孩
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑,不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
[基金申请] 人气不行了 +11 fansofjerry 2026-08-21 11/550 2026-08-25 11:04 by 孤独的英雄6
[教师之家] 导师吐槽:我怎么摊上了这么个极品研究生! +3 苏东坡二世 2026-08-23 3/150 2026-08-25 10:35 by shisan1313
信息提示
请填处理意见