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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌落PCR目的条带浅，测序回来不对
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cherry--

金虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR目的条带浅，测序回来不对 已有3人参与

菌落PCR有目的条带但是很浅，送去测序回来与自己序列比对不上，到ncbi中blast后同源性都是果蝇等昆虫类的物种，不知是哪步出了问题，求大神帮助
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1楼 2015-04-07 12:56:23
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sh_9153

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cherry--: 金币+1, ★有帮助 2015-04-07 18:03:28
菌落PCR本来就是一个相对的验证结果，以便于自己缩小验证范围，不能保证100%准确，测序结果不正确，在你确定自己测序引物特异性和正确性的前提下，证明自己构建有问题
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2楼2015-04-07 13:50:52
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cherry--: 金币+1 2015-04-07 18:03:39
既然自己到blast上比对过了是正确的了，说明是测序出问题了吧。。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-04-07 13:56:37
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cherry--: 金币+2 2015-04-07 18:03:54
菌P不亮多半就是假阳性的了，拿提的质粒双酶切试一试能切开再送去测序

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天道酬勤
4楼2015-04-07 16:58:02
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cherry--

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-04-07 13:56:37
既然自己到blast上比对过了是正确的了，说明是测序出问题了吧。。

比对不是正确的，我的基因是软体动物里的基因
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5楼2015-04-07 17:48:47
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cherry--

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2015-04-07 16:58:02
菌P不亮多半就是假阳性的了，拿提的质粒双酶切试一试能切开再送去测序

什么是假阳性呀，如果是载体自连就不会p出条带，若是目的基因导进去怎么会涨菌呢？
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6楼2015-04-07 18:08:47
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-04-08 09:33:38
cherry--: 金币+1, ★★★很有帮助, 明白了 太感谢了 我又重新做了一次把很亮的送去测序 这回比对上了 2015-04-08 10:16:23
引用回帖:
6楼: Originally posted by cherry-- at 2015-04-07 18:08:47
什么是假阳性呀，如果是载体自连就不会p出条带，若是目的基因导进去怎么会涨菌呢？...

你在涂板的时候会把没有连上的片段也涂在培养基表面，这样挑菌做PCR的时候自然也是能够P出条带来的，所以一般是选取菌落pcr高亮的摇菌提质粒，然后双酶切再验证一下，因为你连上目的基因那一定也是能再切出来的，再送测序这样把握更大一些

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天道酬勤
7楼2015-04-07 18:58:43
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ladtalent

至尊木虫 (著名写手)
不亮的话九成九是假阳性，如果成功插入的话随便P一下都很亮的
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8楼2015-04-09 12:57:24
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wjasaa

金虫 (初入文坛)
菌落PCR同时带上阳性对照和阴性对照，可以稍微避免一些假阳性，同时能自己小提质粒酶切验证就更好了。
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WWW.ABMGOOD.COM
9楼2015-04-10 16:08:04
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