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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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cherry--

金虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR目的条带浅,测序回来不对 已有3人参与

菌落PCR有目的条带但是很浅,送去测序回来与自己序列比对不上,到ncbi中blast后同源性都是果蝇等昆虫类的物种,不知是哪步出了问题,求大神帮助
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-04-08 09:33:38
cherry--: 金币+1, ★★★很有帮助, 明白了 太感谢了 我又重新做了一次把很亮的送去测序 这回比对上了 2015-04-08 10:16:23
引用回帖:
6楼: Originally posted by cherry-- at 2015-04-07 18:08:47
什么是假阳性呀,如果是载体自连就不会p出条带,若是目的基因导进去怎么会涨菌呢?...

你在涂板的时候会把没有连上的片段也涂在培养基表面,这样挑菌做PCR的时候自然也是能够P出条带来的,所以一般是选取菌落pcr高亮的摇菌提质粒,然后双酶切再验证一下,因为你连上目的基因那一定也是能再切出来的,再送测序这样把握更大一些

[ 发自小木虫客户端 ]
天道酬勤
7楼2015-04-07 18:58:43
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sh_9153

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
cherry--: 金币+1, 有帮助 2015-04-07 18:03:28
菌落PCR本来就是一个相对的验证结果,以便于自己缩小验证范围,不能保证100%准确,测序结果不正确,在你确定自己测序引物特异性和正确性的前提下,证明自己构建有问题
2楼2015-04-07 13:50:52
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
cherry--: 金币+1 2015-04-07 18:03:39
既然自己到blast上比对过了是正确的了,说明是测序出问题了吧。。
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-04-07 13:56:37
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
cherry--: 金币+2 2015-04-07 18:03:54
菌P不亮多半就是假阳性的了,拿提的质粒双酶切试一试能切开再送去测序

[ 发自小木虫客户端 ]
天道酬勤
4楼2015-04-07 16:58:02
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