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汕头大学海洋科学接受调剂
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坦荡荡2014

新虫 (初入文坛)

[求助] 如何提高毕赤酵母的表达量 已有2人参与

大家好,我这里有一个问题想请这里的前辈们帮忙解决一下,我们实验室已经将外源蛋白转入毕赤酵母中,外源蛋白的A+T区已经进行了同义密码子的替换,并去除了原有的信号肽,并对密码子和发酵条件进行了优化,一直处于摇瓶表达状态,可是表达量一直很低,该怎么办?上灌会有明显的提高吗,还是要换一种载体呢?我们原来用的载体是pPIC9K~启动子是pAOX1,麻烦有经验的前辈们指教一下~
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新版西游记

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-03-24 09:17:53
坦荡荡2014: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-03-24 12:57:30
做高拷贝筛选。9k是高拷贝载体,用g418梯度筛选,一般拷贝数高表达量高。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
勇往直前
2楼2015-03-23 20:55:01
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坦荡荡2014

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 新版西游记 at 2015-03-23 20:55:01
做高拷贝筛选。9k是高拷贝载体,用g418梯度筛选,一般拷贝数高表达量高。

前期,师姐已经试过把拷贝数提高,可是表达量还是不理想~
3楼2015-03-24 08:32:47
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坦荡荡2014

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 新版西游记 at 2015-03-23 20:55:01
做高拷贝筛选。9k是高拷贝载体,用g418梯度筛选,一般拷贝数高表达量高。

谢谢你谢谢你的回复,请问还有什么方法可以解决吗?您也是做酵母这块的吗?

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2015-03-24 08:42:04
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-03-24 09:17:57
坦荡荡2014: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-03-24 12:57:54
做实验条件优化是重点,载体最好用几种同时尝试 最终选择出最佳载体,既然现在表达量低,表达条件肯定不是最优的呗,建议进行多条件探索。摇瓶表达量低,上罐也不会有很大提高
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
5楼2015-03-24 09:12:51
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坦荡荡2014

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-24 09:12:51
做实验条件优化是重点,载体最好用几种同时尝试 最终选择出最佳载体,既然现在表达量低,表达条件肯定不是最优的呗,建议进行多条件探索。摇瓶表达量低,上罐也不会有很大提高

嗯,好的,谢谢你的提议~
6楼2015-03-24 12:58:22
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jjwhl

银虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-24 09:12:51
做实验条件优化是重点,载体最好用几种同时尝试 最终选择出最佳载体,既然现在表达量低,表达条件肯定不是最优的呗,建议进行多条件探索。摇瓶表达量低,上罐也不会有很大提高

楼主,“摇瓶表达量低,上罐也不会有很大提高”是说上罐后,比摇瓶水平下,提高的不会高多少倍呢?一般情况下,不是说会高10-100倍吗
7楼2015-04-20 22:11:17
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luwei13566

木虫 (正式写手)

1·宿主是啥,GS115? SMD1168?
2.诱导条件如何,初始菌体的od值多少?甲醇的量?诱导天数?如何补加的甲醇?多少温度?多少转速?发酵液气味有无明显变化?
3.酵母什么表型?mut+?muts?
4.蛋白表达量很低是啥程度,page能检测出来吗?检测过胞内有目的蛋白积累了没?
5·拷贝数有多少?抗生素筛到多大的浓度?

[ 发自小木虫客户端 ]

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大家相互帮助哈
8楼2015-04-21 01:57:23
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我们飞哈

铜虫 (小有名气)

楼主做不做酿酒酵母?你有ADH2启动子的序列吗?
9楼2015-04-21 08:39:02
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夏至1990

金虫 (小有名气)

小小虫

送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-04-21 01:57:23
1·宿主是啥,GS115? SMD1168?
2.诱导条件如何,初始菌体的od值多少?甲醇的量?诱导天数?如何补加的甲醇?多少温度?多少转速?发酵液气味有无明显变化?
3.酵母什么表型?mut+?muts?
4.蛋白表达量很低是啥程度 ...

你好,我的现在SMD1168,2左右,1%,3天,30度,220rpm,银染可以检测,2mg/ml,求助,1016902450qq,
Sodoyouwanttotakealeapoffaith…orbecomeanoldman,filledwithregret…waitingtodiealone?
10楼2015-04-21 10:28:19
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