应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助 western blot
101/1返回列表
查看: 2461  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

searush

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助 western blot 已有4人参与

请问WB的内参怎么和样品一起跑胶，还有怎么定量蛋白样品及怎么保存蛋白？越具体越好，（本人是新手，求各位大虫帮帮忙）还有湿转60KD左右蛋白条件？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
学术研究
1楼 2014-12-25 21:55:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

searush

铜虫 (初入文坛)
searush: 回帖置顶 2015-01-12 17:07:55
引用回帖:
5楼: Originally posted by 董博士 at 2014-12-28 14:34:47
首先提取蛋白之后要立即检测浓度，用BCA试剂盒或者考马斯亮蓝检测，测好之后可以按40微克一份制样保存，就是和上样缓冲液一起煮；之后每个孔上同样量的蛋白，这样可以保证内参的一致性，如果检测60kd的蛋白，湿转， ...

但是有时浓度很低（1微克/ul） 要是按40微克保存的话  上样量会较大  可能达到50微升；这样就不好上样了  怎么办？请问下一般上样量多少比较合适？
赞一下 回复此楼
学术研究
7楼2015-01-09 21:09:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

searush

铜虫 (初入文坛)
大虫们  帮帮忙吧
回复此楼
学术研究
2楼2014-12-26 10:56:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mumu624

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
searush(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-12-26 20:21:57
目前测定蛋白浓度的方法有很多，BCA或者FOLIN-酚等方法都比较常用；如果是煮完的蛋白保存的话四度和-20度都可以，但是温度低的肯定保存时间长；60kD的蛋白湿转我们一般采用的是冰浴中，横流300mM，2h，效果不错。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2014-12-26 17:58:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

searush

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mumu624 at 2014-12-26 17:58:25
目前测定蛋白浓度的方法有很多，BCA或者FOLIN-酚等方法都比较常用；如果是煮完的蛋白保存的话四度和-20度都可以，但是温度低的肯定保存时间长；60kD的蛋白湿转我们一般采用的是冰浴中，横流300mM，2h，效果不错。

请问蛋白怎么变性保存 需要跟上样缓冲液一起煮吗？上样缓冲液用非变性的缓冲液行吗？
赞一下 回复此楼
学术研究
4楼2014-12-27 17:12:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-12-29 23:06:17
首先提取蛋白之后要立即检测浓度，用BCA试剂盒或者考马斯亮蓝检测，测好之后可以按40微克一份制样保存，就是和上样缓冲液一起煮；之后每个孔上同样量的蛋白，这样可以保证内参的一致性，如果检测60kd的蛋白，湿转，稳流150mA,2h即可，同一张膜还可同时检测内参
赞一下(1人) 回复此楼
医学&统计学
5楼2014-12-28 14:34:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lightno1

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-29 23:06:41
伯乐机子湿转300mA ,1h，完全可以 ，不需要2h。建议转膜过程中更换电泳槽中冰袋，20min一次。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2014-12-29 16:24:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Eva-wen

新虫 (初入文坛)
WB内参与样品同时跑的条件是样品的分子量必须和内参分子量相差较大，不然切胶很难分开两者。蛋白样品定量方法我用的是碧云天BCA法。一般蛋白保存在-20度冰箱。湿转不太清楚，我一般用的是半干转60KD是1.5h
赞一下 回复此楼
8楼2015-03-24 09:46:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Eva-wen

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by searush at 2014-12-27 17:12:14
请问蛋白怎么变性保存 需要跟上样缓冲液一起煮吗？上样缓冲液用非变性的缓冲液行吗？...

是的，变形是为了将SDS与蛋白质充分结合，使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷。上样蛋白就是蛋白和上样缓冲液等比例配制，98度煮10分钟.
赞一下 回复此楼
9楼2015-03-24 09:55:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lavender_li

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

内参和样品一起跑胶是什么意思？你的蛋白质样品里不含有内参的蛋白质？
你是不是想说同一块膜看不同的蛋白质的意思？
如果是的话，内参和目标蛋白分子量差得多最好，直接切开就行了。
分子量如果相差不大就得reprobe ，把之前接的抗体全都洗下去。不过同一块膜reprobe 不要太多次
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2015-03-24 12:22:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 searush 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 302求调剂 +4 锦衣卫藤椒 2026-03-25 4/200 2026-03-25 16:29 by 功夫疯狂
[考研] 359求调剂 +3 王了个楠 2026-03-25 3/150 2026-03-25 12:50 by Dyhoer
[考研] 材料调剂 +3 iwinso 2026-03-23 3/150 2026-03-25 11:29 by greychen00
[考研] 一志愿 西北大学 ，070300化学学硕，总分287，双非一本，求调剂。 +4 晨昏线与星海 2026-03-20 4/200 2026-03-25 10:16 by allen-yin
[考研] 300分，材料，求调剂，英一数二 +5 超赞的 2026-03-24 5/250 2026-03-24 21:07 by 星空星月
[考研] 306求0703调剂一志愿华中师范 +10 纸鱼ly 2026-03-21 11/550 2026-03-24 17:22 by qingfeng258
[考研] 291求调剂 +3 HanBeiNingZC 2026-03-24 3/150 2026-03-24 16:34 by barlinike
[考研] 材料专硕331求调剂 +4 鲜当牛 2026-03-24 4/200 2026-03-24 15:58 by JourneyLucky
[考研] 305分求调剂（食品工程） +5 Sxy112 2026-03-21 7/350 2026-03-24 12:27 by 544594351
[考研] 333求调剂 +3 ALULU4408 2026-03-23 3/150 2026-03-23 19:04 by macy2011
[考研] 350求调剂 +6 weudhdk 2026-03-19 6/300 2026-03-23 15:47 by tangyuan0840221
[考研] 材料与化工085600，总分304，本科有两篇sci参与，求调剂 +4 幸运的酱酱 2026-03-22 5/250 2026-03-22 20:15 by edmund7
[考研] 求调剂 +5 Zhangbod 2026-03-21 7/350 2026-03-22 13:13 by Zhangbod
[考研] 0703化学调剂 +4 妮妮ninicgb 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:39 by 学员8dgXkO
[考研] 求调剂 +3 13341 2026-03-20 3/150 2026-03-21 18:28 by 学员8dgXkO
[考研] 一志愿深大，0703化学，总分302，求调剂 +4 七月-七七 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:20 by 学员8dgXkO
[考研] 求调剂 +3 .m.. 2026-03-21 4/200 2026-03-21 16:25 by barlinike
[考研] 考研调剂求学校推荐 +3 伯乐29 2026-03-18 5/250 2026-03-20 22:59 by JourneyLucky
[考研] 317求调剂 +5 申子申申 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:26 by JourneyLucky
[考研] A区线材料学调剂 +5 周周无极 2026-03-20 5/250 2026-03-20 21:33 by laoshidan
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭