【答案】应助回帖

1楼2013-11-06 11:22:11

凌波丽

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【答案】应助回帖

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wenxiaowu: 金币+20, ★有帮助 2013-11-07 11:57:22

楼主说的如果是转移蛋白质到膜上的效率低，那么可以有如下解决方法（湿转）：
1.转移缓冲溶液中加入终浓度为20%的甲醇溶液，甲醇可以降低蛋白质洗脱效率，但是增加蛋白质与NC膜的结合能力；甲醇可以防止凝胶变形；甲醇对于高分子蛋白质可延长转移时间。
2.转移缓冲溶液中加入终浓度为0.1%的SDS。转膜实际上就是让蛋白质进入硝纤膜的纤维分子之间的空隙，所以蛋白质变成线状比较容易渗入到硝纤膜的纤维分子之间，因为空间位阻小，且不容易在掉下来，所以在转膜缓冲液中加入矢量浓度的SDS（可配置为：终浓度为0.1%这个浓度不可让蛋白质完全变为线状，不然会影响后面的免疫识别）使得蛋白质的空间构象变为线形比较容易操作成功。热变性的蛋白质的空间构象不是完全线形的，其中还存在很多的二级结构，尽管并非天然二级结构，但是仍然对于蛋白质进入硝纤膜的纤维分子之间的空隙会构成位阻效应，在大分子量的蛋白质中的热变性的非天然二级结构更多，所以位阻效应在转膜时更加明显。至于免疫反应那一步，抗体识别抗原的免疫决定簇有空间免疫决定簇也有序列免疫决定簇，一般只要不是蛋白质完全变为线形且无序列免疫决定簇，就不会没有免疫识别的现象出现。
3.使用小孔径的NC膜，孔径0.2um的膜。
4.使用戊二醛交联蛋白质。上样后可以用戊二醛交联膜上的蛋白质，这样蛋白质自身构成的网络与NC膜的纤维网络会彼此交叉构成约束，使得NC膜上的蛋白质不易被洗下来。
5.对于大分子量的蛋白质，转膜时电压要高一点，一般恒压100V，限流400mA，时间也要延长一点，比3小时要长，开始最好也用两块膜，注意加强降温措施，在槽的一边放一块冰来降温。
6.适当增加转膜时间。
对于大分子量的蛋白质，转膜时电压要高一点，一般恒压100V，限流400mA，时间也要延长一点，比3小时要长，注意加强降温措施，在槽的一边放一块冰来降温。

2楼2013-11-06 12:25:40

wenxiaowu

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-11-06 12:25:40
楼主说的如果是转移蛋白质到膜上的效率低，那么可以有如下解决方法（湿转）：
1.转移缓冲溶液中加入终浓度为20%的甲醇溶液，甲醇可以降低蛋白质洗脱效率，但是增加蛋白质与NC膜的结合能力；甲醇可以防止凝胶变形； ...

哦，我现在是转膜没有问题，就是抗体孵育后出现如上图所示那样。另外，我的胰岛素非内源性的，是买的注射液直接做的，不知抗体能不能与抗体反应。但是我用Elisa可以检出来

3楼2013-11-07 12:00:09

daibingling

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-11-07 15:59:08
wenxiaowu: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-11-07 17:10:12

你可以从以下改进实验：1.一抗用5%BSA配制，然后4度孵育过夜。2.二抗有可能污染，重新配置。

4楼2013-11-07 15:07:14

wenxiaowu

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4楼: Originally posted by daibingling at 2013-11-07 15:07:14
你可以从以下改进实验：1.一抗用5%BSA配制，然后4度孵育过夜。2.二抗有可能污染，重新配置。

用BSA、脱脂奶粉、TBST有什么区别呢？我是过夜孵育的
二抗被什么污染了？
我用脱脂奶粉稀释的抗体，做出来纯粹一点发光都没有，漆黑一片。

5楼2013-11-07 17:13:04

daibingling

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wenxiaowu: 金币+15, ★★★很有帮助 2013-11-08 10:46:19

引用回帖:

5楼: Originally posted by wenxiaowu at 2013-11-07 17:13:04
用BSA、脱脂奶粉、TBST有什么区别呢？我是过夜孵育的
二抗被什么污染了？
我用脱脂奶粉稀释的抗体，做出来纯粹一点发光都没有，漆黑一片。...

配制一抗，加入BSA，脱脂奶粉就是起到一个封闭非特异性位点的作用。二抗有可能在用的过程中，被实验中所用的耗材等污染。你说的这种现象我也遇到过，就是把每个步骤，都重新认真改正，就没问题了，祝好运

6楼2013-11-07 18:40:26

wenxiaowu

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6楼: Originally posted by daibingling at 2013-11-07 18:40:26
配制一抗，加入BSA，脱脂奶粉就是起到一个封闭非特异性位点的作用。二抗有可能在用的过程中，被实验中所用的耗材等污染。你说的这种现象我也遇到过，就是把每个步骤，都重新认真改正，就没问题了，祝好运...

哦，我的胰岛素外源性的，是买的注射液直接做的，不知抗体能不能与它反应。抗体是不是只能和内源性的抗原反应？

7楼2013-11-08 10:48:14