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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药理学 » western抗体稀释、孵育的时间与条件的疑惑与不解
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xiajing_acm

新虫 (小有名气)

[求助] western抗体稀释、孵育的时间与条件的疑惑与不解

各位大侠：

        你们好！请问做western时抗体一般用什么稀释好，TBST还是封闭液啊？加入一抗后是4°C孵育过夜好呢还是室温下2h好呢？若是4°孵育过夜需要在把摇床上放到冰箱/柜里震荡过夜吗？可是冰箱/冰柜有插座可以提供摇床的电源吗？

        还有二抗呢？室温一般孵育多久呢？谢谢啦！小弟新手兼菜鸟，恳请大侠们多多指点！
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1楼2011-05-03 21:47:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

xuehua0222

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
karl2100(金币+1): 谢谢参与讨论！ 2011-05-09 19:06:50
xiajing_acm(金币+2): 2011-05-09 20:58:45
xiajing_acm(金币+1): 谢谢 2011-07-05 16:43:59
一抗4度冰箱过夜，二抗室温一小时，根据我的经验二抗室温2小时以后背景太高啦~~都用TBST稀释哇！
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7楼2011-05-09 16:01:57
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yubingying

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

xiajing_acm(金币+4): 2011-05-09 13:37:24
我一般用封闭液稀释一抗，4°冰箱过夜，不用在冰箱里摇，第二天取出来再摇1到2小时，用TBST洗去一抗，再加二抗，二抗也是用封闭液稀释的，在摇床上孵2小时，洗去就可以显影啦，希望能给你提供些参考。
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今天不努力，明日徒伤悲
6楼2011-05-08 21:19:56
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nieyaru

新虫 (小有名气)
我用的抗体稀释液，这个可以重复用个3~4次，二抗用的是5%的封闭液稀释的;一抗孵育室温1h或4℃过夜，二抗一般室温孵育1h.
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9楼2012-07-08 02:01:40
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喵一咪

新虫 (初入文坛)
我们一抗和二抗一般都用的TBST稀释的，抗体稀释倍数和孵育时间跟抗体的效价有关，但是要注意如果一抗本身稀释的倍数就不高，二抗最好稀释倍数高一些，不然会出现假阳性杂交条带，最好在摇床上孵育也能避免非特异性蛋白结合，室温就可以，我的一抗二抗都孵育1.5h，希望对你有帮助~
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10楼2012-12-25 14:01:47
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普通回帖

simplelcc

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
jiangchunyong(金币+1): 谢谢！ 2011-05-05 12:40:54
xiajing_acm(金币+2): 2011-05-05 19:49:39
xiajing_acm(金币+1): 谢谢 2011-07-05 16:44:36
我一般用TBST稀释抗体，一抗冰箱孵育过夜；二抗室温2h；我是倒扣着孵，所以都不摇。
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2楼2011-05-05 12:34:01
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snailtt

捐助贵宾 (小有名气)
师兄确实在冰箱摇过夜的，还专为此买了个小摇床和两孔的劣质插座，为了线够细能关上门。我自己也是小菜鸟，还在养细胞~
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3楼2011-05-05 19:58:39
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wenzhiren

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

xiajing_acm(金币+3): 2011-05-07 20:51:39
引用回帖:
Originally posted by xiajing_acm at 2011-05-03 21:47:41:
各位大侠：

        你们好！请问做western时抗体一般用什么稀释好，TBST还是封闭液啊？加入一抗后是4°C孵育过夜好呢还是室温下2h好呢？若是4°孵育过夜需要在把摇床上放到冰箱/柜里震荡过夜吗？可是冰箱/冰柜 ...

1、一抗用缓冲液稀释即可。
2、孵育时间根据实验结果来摸索。
3、若4°过夜，条件容许的话，最好使用摇床。没有条件在冰箱里放摇床，那就直接放4°过夜好了，第二天摇床上多洗几次。摇床可以放到恒温层析柜里面。
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4楼2011-05-06 17:28:30
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sntyc

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

xiajing_acm(金币+2): 2011-05-08 15:17:01
xiajing_acm(金币+1): 谢谢 2011-07-05 16:43:41
根据抗体说明书上的要求孵育一抗，我们CST都是四度过夜，二抗根据你的室温1-2小时
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5楼2011-05-07 21:07:41
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noah1020

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

xiajing_acm(金币+4): 2011-05-15 19:53:29
我们实验室用的是进口的抗体，用封闭液稀释，因为说明上明确说要用blocking solution or 5% BSA来稀释抗体效果最好~一般一抗要4度孵育过夜，你订一个最简单的摇床，把电源甩出来插在外面，然后关上冰箱门就行，没问题的，我们一直这样~二抗一般第二天来了孵育1个小时就行了~
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8楼2011-05-13 13:05:31
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