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searush

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助 western blot 已有4人参与

请问WB的内参怎么和样品一起跑胶，还有怎么定量蛋白样品及怎么保存蛋白？越具体越好，（本人是新手，求各位大虫帮帮忙）还有湿转60KD左右蛋白条件？
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学术研究
1楼 2014-12-25 21:55:25
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searush

铜虫 (初入文坛)
大虫们  帮帮忙吧
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学术研究
2楼2014-12-26 10:56:47
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mumu624

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
searush(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-12-26 20:21:57
目前测定蛋白浓度的方法有很多，BCA或者FOLIN-酚等方法都比较常用；如果是煮完的蛋白保存的话四度和-20度都可以，但是温度低的肯定保存时间长；60kD的蛋白湿转我们一般采用的是冰浴中，横流300mM，2h，效果不错。
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3楼2014-12-26 17:58:25
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searush

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mumu624 at 2014-12-26 17:58:25
目前测定蛋白浓度的方法有很多，BCA或者FOLIN-酚等方法都比较常用；如果是煮完的蛋白保存的话四度和-20度都可以，但是温度低的肯定保存时间长；60kD的蛋白湿转我们一般采用的是冰浴中，横流300mM，2h，效果不错。

请问蛋白怎么变性保存 需要跟上样缓冲液一起煮吗？上样缓冲液用非变性的缓冲液行吗？
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学术研究
4楼2014-12-27 17:12:14
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-12-29 23:06:17
首先提取蛋白之后要立即检测浓度，用BCA试剂盒或者考马斯亮蓝检测，测好之后可以按40微克一份制样保存，就是和上样缓冲液一起煮；之后每个孔上同样量的蛋白，这样可以保证内参的一致性，如果检测60kd的蛋白，湿转，稳流150mA,2h即可，同一张膜还可同时检测内参
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医学&统计学
5楼2014-12-28 14:34:47
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lightno1

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-29 23:06:41
伯乐机子湿转300mA ,1h，完全可以 ，不需要2h。建议转膜过程中更换电泳槽中冰袋，20min一次。
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6楼2014-12-29 16:24:56
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searush

铜虫 (初入文坛)
searush: 回帖置顶 2015-01-12 17:07:55
引用回帖:
5楼: Originally posted by 董博士 at 2014-12-28 14:34:47
首先提取蛋白之后要立即检测浓度，用BCA试剂盒或者考马斯亮蓝检测，测好之后可以按40微克一份制样保存，就是和上样缓冲液一起煮；之后每个孔上同样量的蛋白，这样可以保证内参的一致性，如果检测60kd的蛋白，湿转， ...

但是有时浓度很低（1微克/ul） 要是按40微克保存的话  上样量会较大  可能达到50微升；这样就不好上样了  怎么办？请问下一般上样量多少比较合适？
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学术研究
7楼2015-01-09 21:09:32
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Eva-wen

新虫 (初入文坛)
WB内参与样品同时跑的条件是样品的分子量必须和内参分子量相差较大，不然切胶很难分开两者。蛋白样品定量方法我用的是碧云天BCA法。一般蛋白保存在-20度冰箱。湿转不太清楚，我一般用的是半干转60KD是1.5h
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8楼2015-03-24 09:46:49
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Eva-wen

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by searush at 2014-12-27 17:12:14
请问蛋白怎么变性保存 需要跟上样缓冲液一起煮吗？上样缓冲液用非变性的缓冲液行吗？...

是的，变形是为了将SDS与蛋白质充分结合，使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷。上样蛋白就是蛋白和上样缓冲液等比例配制，98度煮10分钟.
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9楼2015-03-24 09:55:23
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lavender_li

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

内参和样品一起跑胶是什么意思？你的蛋白质样品里不含有内参的蛋白质？
你是不是想说同一块膜看不同的蛋白质的意思？
如果是的话，内参和目标蛋白分子量差得多最好，直接切开就行了。
分子量如果相差不大就得reprobe ，把之前接的抗体全都洗下去。不过同一块膜reprobe 不要太多次
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10楼2015-03-24 12:22:40
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