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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助 western blot
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searush

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助 western blot 已有4人参与

请问WB的内参怎么和样品一起跑胶，还有怎么定量蛋白样品及怎么保存蛋白？越具体越好，（本人是新手，求各位大虫帮帮忙）还有湿转60KD左右蛋白条件？
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学术研究
1楼 2014-12-25 21:55:25
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mumu624

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
searush(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-12-26 20:21:57
目前测定蛋白浓度的方法有很多，BCA或者FOLIN-酚等方法都比较常用；如果是煮完的蛋白保存的话四度和-20度都可以，但是温度低的肯定保存时间长；60kD的蛋白湿转我们一般采用的是冰浴中，横流300mM，2h，效果不错。
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3楼2014-12-26 17:58:25
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searush

铜虫 (初入文坛)
大虫们  帮帮忙吧
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学术研究
2楼2014-12-26 10:56:47
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searush

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mumu624 at 2014-12-26 17:58:25
目前测定蛋白浓度的方法有很多，BCA或者FOLIN-酚等方法都比较常用；如果是煮完的蛋白保存的话四度和-20度都可以，但是温度低的肯定保存时间长；60kD的蛋白湿转我们一般采用的是冰浴中，横流300mM，2h，效果不错。

请问蛋白怎么变性保存 需要跟上样缓冲液一起煮吗？上样缓冲液用非变性的缓冲液行吗？
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学术研究
4楼2014-12-27 17:12:14
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-12-29 23:06:17
首先提取蛋白之后要立即检测浓度，用BCA试剂盒或者考马斯亮蓝检测，测好之后可以按40微克一份制样保存，就是和上样缓冲液一起煮；之后每个孔上同样量的蛋白，这样可以保证内参的一致性，如果检测60kd的蛋白，湿转，稳流150mA,2h即可，同一张膜还可同时检测内参
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医学&统计学
5楼2014-12-28 14:34:47
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