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qincaiyan615

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教各位,怎么才能知道western曝光的条带是否是我要的蛋白呢? 已有5人参与

请教各位,我在做western,我的目的蛋白是10kd,但曝光的条带与Marker比是58kd左右,也没背景,也没其他的带,条带还比较漂亮,我怎么才能知道这条带是否是我要的蛋白呢?
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wutianyu1208

铜虫 (正式写手)


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-10 15:21:01
那肯定不是啊。你配的多大的胶,跑的时候是什么多少伏,转模是什么条件啊?不说清楚没法分析

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-11-10 08:01:42
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西昆仑

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-10 15:20:29
如果你一抗二抗没有加错且没有其他条带的话,按理说应该就是了,但你目的条带的位置和显出来的差别太大了。。。建议重新看一下你的目的条带的分子量以及marker的条带说明。
欢迎同行交流
3楼2014-11-10 09:44:44
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-10 15:20:42
58kd是其他蛋白比较多的区段,楼主需谨慎。跟你的目的size差太多,很可能不是。
10kd很小,多load一些样品试试,再多加点一抗,注意别跑过了。。
祝好运啊
Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
4楼2014-11-10 11:00:45
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593318518

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-10 15:20:49
形成多聚体也不是不可能或者蛋白与其他蛋白形成复合体。可以将条带cut下来送去做质谱测序
5楼2014-11-10 11:32:56
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qincaiyan615

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wutianyu1208 at 2014-11-10 08:01:42
那肯定不是啊。你配的多大的胶,跑的时候是什么多少伏,转模是什么条件啊?不说清楚没法分析

我用的是Tris- gly胶,分离胶15%,110v跑,浓缩胶5%,65V跑,转膜,稳流200mA,1h。后来听说,小分子蛋白用Tricine-SDS-PAGE跑胶效果好,就用了,但跑的还是58kd左右,很奇怪
6楼2014-11-11 00:16:06
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wutianyu1208

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by qincaiyan615 at 2014-11-11 00:16:06
我用的是Tris- gly胶,分离胶15%,110v跑,浓缩胶5%,65V跑,转膜,稳流200mA,1h。后来听说,小分子蛋白用Tricine-SDS-PAGE跑胶效果好,就用了,但跑的还是58kd左右,很奇怪...

分离胶多跑一会,把胶混匀。

[ 发自小木虫客户端 ]
7楼2014-11-11 01:42:59
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sun_in_night

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
qincaiyan615(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-25 13:16:14
做一个阴性对照,一个不应该有你的目的蛋白的对照,这样你就能知道那条带到底是非特异的条带还是真的你的条带。理论上来说蛋白大小不会差那么多,哪怕是有修饰,有蛋白聚合(变性了,理论上应该没有)。
8楼2014-11-11 04:03:42
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biotech_zhou

木虫 (著名写手)

待人以诚:专业/专注/专心

【答案】应助回帖

差别也太大了,确定抗体买对了么?
年末优惠荧光定量pcr、WB、ELISA技术服务一律六折!交流锤炼知识,用心构筑桥梁,以更优质的产品及技术服务助力科研;QQ:2513165427;Email:b
9楼2014-11-25 10:59:19
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