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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 请教各位，怎么才能知道western曝光的条带是否是我要的蛋白呢？
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qincaiyan615

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教各位，怎么才能知道western曝光的条带是否是我要的蛋白呢？已有5人参与

请教各位，我在做western，我的目的蛋白是10kd，但曝光的条带与Marker比是58kd左右，也没背景，也没其他的带，条带还比较漂亮，我怎么才能知道这条带是否是我要的蛋白呢？
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1楼2014-11-10 00:01:57
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wutianyu1208

铜虫 (正式写手)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-10 15:21:01
那肯定不是啊。你配的多大的胶，跑的时候是什么多少伏，转模是什么条件啊？不说清楚没法分析

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2楼2014-11-10 08:01:42
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西昆仑

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-10 15:20:29
如果你一抗二抗没有加错且没有其他条带的话，按理说应该就是了，但你目的条带的位置和显出来的差别太大了。。。建议重新看一下你的目的条带的分子量以及marker的条带说明。
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欢迎同行交流
3楼2014-11-10 09:44:44
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-10 15:20:42
58kd是其他蛋白比较多的区段，楼主需谨慎。跟你的目的size差太多，很可能不是。
10kd很小，多load一些样品试试，再多加点一抗，注意别跑过了。。
祝好运啊
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
4楼2014-11-10 11:00:45
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593318518

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-10 15:20:49
形成多聚体也不是不可能或者蛋白与其他蛋白形成复合体。可以将条带cut下来送去做质谱测序
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5楼2014-11-10 11:32:56
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qincaiyan615

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wutianyu1208 at 2014-11-10 08:01:42
那肯定不是啊。你配的多大的胶，跑的时候是什么多少伏，转模是什么条件啊？不说清楚没法分析

我用的是Tris- gly胶，分离胶15%，110v跑，浓缩胶5%，65V跑，转膜，稳流200mA,1h。后来听说，小分子蛋白用Tricine-SDS-PAGE跑胶效果好，就用了，但跑的还是58kd左右，很奇怪
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6楼2014-11-11 00:16:06
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wutianyu1208

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by qincaiyan615 at 2014-11-11 00:16:06
我用的是Tris- gly胶，分离胶15%，110v跑，浓缩胶5%，65V跑，转膜，稳流200mA,1h。后来听说，小分子蛋白用Tricine-SDS-PAGE跑胶效果好，就用了，但跑的还是58kd左右，很奇怪...

分离胶多跑一会，把胶混匀。

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7楼2014-11-11 01:42:59
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sun_in_night

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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qincaiyan615(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-25 13:16:14
做一个阴性对照，一个不应该有你的目的蛋白的对照，这样你就能知道那条带到底是非特异的条带还是真的你的条带。理论上来说蛋白大小不会差那么多，哪怕是有修饰，有蛋白聚合（变性了，理论上应该没有）。
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8楼2014-11-11 04:03:42
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biotech_zhou

木虫 (著名写手)

待人以诚：专业/专注/专心

【答案】应助回帖

差别也太大了，确定抗体买对了么？
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年末优惠荧光定量pcr、WB、ELISA技术服务一律六折！交流锤炼知识，用心构筑桥梁，以更优质的产品及技术服务助力科研；QQ：2513165427；Email：b
9楼2014-11-25 10:59:19
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