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pushizi木虫 (小有名气)
pushizi
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[求助]
示踪色素覆盖在蛋白条带上-western blot结果很难看-求解决
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最近在进行一个约为14 kD大小蛋白的western blot实验，很郁闷的是：电泳出来后，我的蛋白条带就在loading buffer的指示剂（考马斯亮蓝（G250））的蓝色部分区域，将其转到硝酸纤维素膜后，蓝色的染料也能转到膜上，显色完条带就跟蓝色的交杂在一起，非常难看。思考以下解决方案，请大家多提建议，哪条可行： （1）换用胶的浓度：现在用的是15%的胶。是否应该换用20%的胶浓度？看一些帖子里好像指示剂的快慢在不同的胶浓度中不同。20%的胶中指示剂的大小在哪里？有没有虫友做过啊？另外，14kD的蛋白是不是用20%的胶浓度有点夸张啊？ （2）将示踪剂换为溴酚蓝？看一些帖子中有人说溴酚蓝能跑在7 kD的蛋白以下，又有人说在17kD左右，有否确定的说法啊？请注下胶浓度~~ （3）能否不加指示剂啊？仅用甘油沉淀蛋白，然后用预染marker进行指示？这个过程有人做过么？会有问题么？另外，甘油的终浓度采用多少比较好啊？ 最后，再请教大家一个问题，在做western blot的过程中，条带总是溢出，我不确定每个样品（全细胞裂解液）中我的目的蛋白有多少，那么我除了反复试验，减少上样量之外，有没有其他什么快速简便的方法来解决？ 感谢从头看到尾的朋友们！更加感谢能够为我解答的各位好心人！在此先谢过！！ |
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