应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 示踪色素覆盖在蛋白条带上-western blot结果很难看-求解决
61/1返回列表
查看: 1224  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

pushizi

木虫 (小有名气)

pushizi

[求助] 示踪色素覆盖在蛋白条带上-western blot结果很难看-求解决

最近在进行一个约为14 kD大小蛋白的western blot实验，很郁闷的是：电泳出来后，我的蛋白条带就在loading buffer的指示剂（考马斯亮蓝（G250））的蓝色部分区域，将其转到硝酸纤维素膜后，蓝色的染料也能转到膜上，显色完条带就跟蓝色的交杂在一起，非常难看。思考以下解决方案，请大家多提建议，哪条可行：
（1）换用胶的浓度：现在用的是15%的胶。是否应该换用20%的胶浓度？看一些帖子里好像指示剂的快慢在不同的胶浓度中不同。20%的胶中指示剂的大小在哪里？有没有虫友做过啊？另外，14kD的蛋白是不是用20%的胶浓度有点夸张啊？
（2）将示踪剂换为溴酚蓝？看一些帖子中有人说溴酚蓝能跑在7 kD的蛋白以下，又有人说在17kD左右，有否确定的说法啊？请注下胶浓度~~
（3）能否不加指示剂啊？仅用甘油沉淀蛋白，然后用预染marker进行指示？这个过程有人做过么？会有问题么？另外，甘油的终浓度采用多少比较好啊？
最后，再请教大家一个问题，在做western blot的过程中，条带总是溢出，我不确定每个样品（全细胞裂解液）中我的目的蛋白有多少，那么我除了反复试验，减少上样量之外，有没有其他什么快速简便的方法来解决？
感谢从头看到尾的朋友们！更加感谢能够为我解答的各位好心人！在此先谢过！！
回复此楼

» 猜你喜欢
但愿快乐不停歇，悲伤不再来~
1楼 2013-08-09 19:52:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
pushizi: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-08-10 09:59:13
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-08-10 12:00:00
15%的胶没有问题啊，一般的loading buffer在10k左右。14k完全能分开。转膜前用Towbin buffer多洗一会儿，loading buffer会掉的。再转就没啥问题了。Western足够灵敏，你没有必要上太多样的。减少上样量就行了。
赞一下 回复此楼
Let'sdoit.
2楼2013-08-10 00:25:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pushizi

木虫 (小有名气)

pushizi
引用回帖:
2楼: Originally posted by yimingwang at 2013-08-10 00:25:48
15%的胶没有问题啊，一般的loading buffer在10k左右。14k完全能分开。转膜前用Towbin buffer多洗一会儿，loading buffer会掉的。再转就没啥问题了。Western足够灵敏，你没有必要上太多样的。减少上样量就行了。

请问您的loading buffer里面的染料是什么啊？
赞一下 回复此楼
但愿快乐不停歇，悲伤不再来~
3楼2013-08-10 10:00:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
pushizi: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-08-13 13:26:45
引用回帖:
3楼: Originally posted by pushizi at 2013-08-10 03:00:27
请问您的loading buffer里面的染料是什么啊？...

4x sample buffer 10 mL :  
2.0 ml 1M Tris-HCl pH 6.8
    0.8 g SDS
    4.0 ml 100% glycerol
    0.4 ml 14.7 M β-mercaptoethanol
    1.0 ml 0.5 M EDTA
    8 mg bromophenol Blue
赞一下 回复此楼
Let'sdoit.
4楼2013-08-13 03:46:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pushizi

木虫 (小有名气)

pushizi
引用回帖:
4楼: Originally posted by yimingwang at 2013-08-13 03:46:55
4x sample buffer 10 mL :  
2.0 ml 1M Tris-HCl pH 6.8
    0.8 g SDS
    4.0 ml 100% glycerol
    0.4 ml 14.7 M β-mercaptoethanol
    1.0 ml 0.5 M EDTA
    8 mg bromophenol Blue...

好的！非常感谢！
后来又咨询了其他人，确实应该用溴酚蓝没有问题。
用第三种解决方法也能用，应该更保险~
赞一下 回复此楼
但愿快乐不停歇，悲伤不再来~
5楼2013-08-13 13:28:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Allen206

银虫 (小有名气)
把修芬兰去掉不久行了，根据经验定时间，别出去就好啦，
赞一下 回复此楼
不想说什么，，，，
6楼2013-08-13 17:47:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 pushizi 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 070303 总分349求调剂 +3 LJY9966 2026-03-15 5/250 2026-03-16 14:24 by xwxstudy
[基金申请] 国自科面上基金字体 +5 iwuli 2026-03-12 6/300 2026-03-16 13:13 by Kamiu_MK
[考研] 本人考085602 化学工程 专硕 +9 不知道叫什么！ 2026-03-15 10/500 2026-03-16 10:04 by houyaoxu
[硕博家园] 深圳大学硕士招生（2026秋，传感器方向，仅录取第一志愿） +4 xujiaoszu 2026-03-11 8/400 2026-03-16 09:45 by xujiaoszu
[考研] 321求调剂 +4 大米饭！ 2026-03-15 4/200 2026-03-16 08:41 by Linda Hu
[考研] 一志愿哈工大材料324分求调剂 +5 闫旭东 2026-03-14 5/250 2026-03-14 14:53 by 木瓜膏
[考研] 267一志愿南京工业大学0817化工求调剂 +5 SUICHILD 2026-03-12 5/250 2026-03-14 14:53 by jean5056
[考研] 【0703化学调剂】-一志愿华中师范大学-六级475 +5 Becho359 2026-03-11 5/250 2026-03-14 11:35 by 哦哦123
[考研] 材料080500调剂求收留 +3 一颗meteor 2026-03-13 3/150 2026-03-14 10:54 by peike
[考研] 学硕285求调剂 +13 Wisjxn 2026-03-12 46/2300 2026-03-14 10:33 by JourneyLucky
[考研] 一志愿华中农业大学071010，总分三百二,求调剂 +3 困困困困坤坤 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:35 by JourneyLucky
[考研] 材料专硕288分求调剂 一志愿211 +4 在家想你 2026-03-11 4/200 2026-03-13 22:49 by JourneyLucky
[考研] 308求调剂 +5 是Lupa啊 2026-03-11 5/250 2026-03-13 22:13 by JourneyLucky
[考研] （081700）化学工程与技术-298分求调剂 +12 11啦啦啦 2026-03-11 35/1750 2026-03-13 21:25 by JourneyLucky
[考研] 274求调剂0856材料化工 +12 z2839474511 2026-03-11 13/650 2026-03-13 10:39 by peike
[考研] 求调剂 资源与环境 285 +3 未名考生 2026-03-10 3/150 2026-03-13 10:31 by houyaoxu
[考研] 一志愿河海大学085900土木水利专硕279求调剂不挑专业 +4 SunWwWwWw 2026-03-10 8/400 2026-03-13 02:23 by SunWwWwWw
[考研] 341求调剂 +4 捣蛋猪猪 2026-03-11 4/200 2026-03-12 14:47 by ruiyingmiao
[考研] 279求调剂 +3 莫xiao 2026-03-10 4/200 2026-03-11 08:06 by 斩魂滴兔子！
[考研] 0703化学调剂 +3 三dd. 2026-03-10 3/150 2026-03-10 15:45 by peike
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭