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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 示踪色素覆盖在蛋白条带上-western blot结果很难看-求解决
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pushizi

木虫 (小有名气)

pushizi

[求助] 示踪色素覆盖在蛋白条带上-western blot结果很难看-求解决

最近在进行一个约为14 kD大小蛋白的western blot实验，很郁闷的是：电泳出来后，我的蛋白条带就在loading buffer的指示剂（考马斯亮蓝（G250））的蓝色部分区域，将其转到硝酸纤维素膜后，蓝色的染料也能转到膜上，显色完条带就跟蓝色的交杂在一起，非常难看。思考以下解决方案，请大家多提建议，哪条可行：
（1）换用胶的浓度：现在用的是15%的胶。是否应该换用20%的胶浓度？看一些帖子里好像指示剂的快慢在不同的胶浓度中不同。20%的胶中指示剂的大小在哪里？有没有虫友做过啊？另外，14kD的蛋白是不是用20%的胶浓度有点夸张啊？
（2）将示踪剂换为溴酚蓝？看一些帖子中有人说溴酚蓝能跑在7 kD的蛋白以下，又有人说在17kD左右，有否确定的说法啊？请注下胶浓度~~
（3）能否不加指示剂啊？仅用甘油沉淀蛋白，然后用预染marker进行指示？这个过程有人做过么？会有问题么？另外，甘油的终浓度采用多少比较好啊？
最后，再请教大家一个问题，在做western blot的过程中，条带总是溢出，我不确定每个样品（全细胞裂解液）中我的目的蛋白有多少，那么我除了反复试验，减少上样量之外，有没有其他什么快速简便的方法来解决？
感谢从头看到尾的朋友们！更加感谢能够为我解答的各位好心人！在此先谢过！！
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但愿快乐不停歇，悲伤不再来~
1楼 2013-08-09 19:52:04
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yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
pushizi: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-08-10 09:59:13
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-08-10 12:00:00
15%的胶没有问题啊，一般的loading buffer在10k左右。14k完全能分开。转膜前用Towbin buffer多洗一会儿，loading buffer会掉的。再转就没啥问题了。Western足够灵敏，你没有必要上太多样的。减少上样量就行了。
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Let'sdoit.
2楼2013-08-10 00:25:48
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pushizi

木虫 (小有名气)

pushizi
引用回帖:
2楼: Originally posted by yimingwang at 2013-08-10 00:25:48
15%的胶没有问题啊，一般的loading buffer在10k左右。14k完全能分开。转膜前用Towbin buffer多洗一会儿，loading buffer会掉的。再转就没啥问题了。Western足够灵敏，你没有必要上太多样的。减少上样量就行了。

请问您的loading buffer里面的染料是什么啊？
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但愿快乐不停歇，悲伤不再来~
3楼2013-08-10 10:00:27
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yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
pushizi: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-08-13 13:26:45
引用回帖:
3楼: Originally posted by pushizi at 2013-08-10 03:00:27
请问您的loading buffer里面的染料是什么啊？...

4x sample buffer 10 mL :  
2.0 ml 1M Tris-HCl pH 6.8
    0.8 g SDS
    4.0 ml 100% glycerol
    0.4 ml 14.7 M β-mercaptoethanol
    1.0 ml 0.5 M EDTA
    8 mg bromophenol Blue
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Let'sdoit.
4楼2013-08-13 03:46:55
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pushizi

木虫 (小有名气)

pushizi
引用回帖:
4楼: Originally posted by yimingwang at 2013-08-13 03:46:55
4x sample buffer 10 mL :  
2.0 ml 1M Tris-HCl pH 6.8
    0.8 g SDS
    4.0 ml 100% glycerol
    0.4 ml 14.7 M β-mercaptoethanol
    1.0 ml 0.5 M EDTA
    8 mg bromophenol Blue...

好的！非常感谢！
后来又咨询了其他人，确实应该用溴酚蓝没有问题。
用第三种解决方法也能用，应该更保险~
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但愿快乐不停歇，悲伤不再来~
5楼2013-08-13 13:28:03
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Allen206

银虫 (小有名气)
把修芬兰去掉不久行了，根据经验定时间，别出去就好啦，
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不想说什么，，，，
6楼2013-08-13 17:47:05
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