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pushizi木虫 (小有名气)
pushizi
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示踪色素覆盖在蛋白条带上-western blot结果很难看-求解决
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最近在进行一个约为14 kD大小蛋白的western blot实验,很郁闷的是:电泳出来后,我的蛋白条带就在loading buffer的指示剂(考马斯亮蓝(G250))的蓝色部分区域,将其转到硝酸纤维素膜后,蓝色的染料也能转到膜上,显色完条带就跟蓝色的交杂在一起,非常难看。思考以下解决方案,请大家多提建议,哪条可行: (1)换用胶的浓度:现在用的是15%的胶。是否应该换用20%的胶浓度?看一些帖子里好像指示剂的快慢在不同的胶浓度中不同。20%的胶中指示剂的大小在哪里?有没有虫友做过啊?另外,14kD的蛋白是不是用20%的胶浓度有点夸张啊? (2)将示踪剂换为溴酚蓝?看一些帖子中有人说溴酚蓝能跑在7 kD的蛋白以下,又有人说在17kD左右,有否确定的说法啊?请注下胶浓度~~ (3)能否不加指示剂啊?仅用甘油沉淀蛋白,然后用预染marker进行指示?这个过程有人做过么?会有问题么?另外,甘油的终浓度采用多少比较好啊? 最后,再请教大家一个问题,在做western blot的过程中,条带总是溢出,我不确定每个样品(全细胞裂解液)中我的目的蛋白有多少,那么我除了反复试验,减少上样量之外,有没有其他什么快速简便的方法来解决? 感谢从头看到尾的朋友们!更加感谢能够为我解答的各位好心人!在此先谢过!! |
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