应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请问20多kD的蛋白做Western可不可以用湿转？另外需要注意些什么？
211/3返回列表123下一页
查看: 3256  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

shenxing325

铜虫 (小有名气)

[求助] 请问20多kD的蛋白做Western可不可以用湿转？另外需要注意些什么？

如题，做了两次Western了，第二次做的时候用立春红染色的时候感觉条带看到了一些，但是结果还是没有条带，预染Marker也不清晰。这次打算用0.22um的膜来做，不知道结果会不会好一些。按理来说小分子应该用半干法，但是操作全是自己摸索的，不大会弄。半干法因为没有海绵的关系，感觉三明治貌似夹不紧啊，是不是滤纸要加多点加到很厚才行呢？请大家帮忙说说自己的经验
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2012-10-17 21:34:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

royxueli

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by novodavid at 2012-10-18 09:01:48
求问你们的湿转条件？我需要转15KD的蛋白，以前是半干，反而不是很好。你们的电流，电压，时间，滤纸层数是多少呢？...

电压是100v。。如果不能恒压就恒流300mA，反正是那个biorad电源的上限了。。上下各两层滤纸，时间是1个小时
赞一下(1人) 回复此楼
11楼2012-10-19 00:26:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

shenxing325

铜虫 (小有名气)
补充一下：另外看到Western的技术手册里说，SDS会阻碍小分子蛋白和膜的结合，但是又说PVDF膜适用于有SDS存在的时候与蛋白质结合。那小分子蛋白用PVDF膜电转液里面到底要不要加SDS呢？加的话浓度多少比较合适？0.04%？0.1%？
赞一下 回复此楼
2楼2012-10-17 21:56:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

royxueli

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-18 18:45:47
20kd的我们都是用的湿转的，效果ok的。。丽春红染色看到的条带基本都是杂带，你要的条带是看不到的。。。。预染的maker看不到？在胶上清不清楚呢？是不是时间不够呢。。buffer没有问题吗。。半干没有做过。。不好意思了。。
赞一下 回复此楼
3楼2012-10-18 00:43:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shenxing325: 金币+2, ★有帮助 2012-10-18 09:07:16
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-18 18:45:57
引用回帖:
2楼: Originally posted by shenxing325 at 2012-10-17 21:56:31
补充一下：另外看到Western的技术手册里说，SDS会阻碍小分子蛋白和膜的结合，但是又说PVDF膜适用于有SDS存在的时候与蛋白质结合。那小分子蛋白用PVDF膜电转液里面到底要不要加SDS呢？加的话浓度多少比较合适？0.04% ...

加不加SDS都可以转20kDa的蛋白。加的话，我的protocol里是用0.0375%。还有就是丽春红染色不如考马斯亮蓝灵敏，只能染出丰度高的蛋白。你的marker也要上很多才可以看得。你可以用prestained的marker，就不用预染直接看到了。
赞一下 回复此楼
4楼2012-10-18 08:22:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

novodavid

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by royxueli at 2012-10-18 00:43:11
20kd的我们都是用的湿转的，效果ok的。。丽春红染色看到的条带基本都是杂带，你要的条带是看不到的。。。。预染的maker看不到？在胶上清不清楚呢？是不是时间不够呢。。buffer没有问题吗。。半干没有做过。。不好意 ...

求问你们的湿转条件？我需要转15KD的蛋白，以前是半干，反而不是很好。你们的电流，电压，时间，滤纸层数是多少呢？
赞一下 回复此楼
5楼2012-10-18 09:01:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by royxueli at 2012-10-18 00:43:11
20kd的我们都是用的湿转的，效果ok的。。丽春红染色看到的条带基本都是杂带，你要的条带是看不到的。。。。预染的maker看不到？在胶上清不清楚呢？是不是时间不够呢。。buffer没有问题吗。。半干没有做过。。不好意 ...

可以可以传授一下你们做20kD蛋白的经验呢？比如说转膜电流多大，多长时间之类的
赞一下 回复此楼
6楼2012-10-18 09:05:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-18 08:22:57
加不加SDS都可以转20kDa的蛋白。加的话，我的protocol里是用0.0375%。还有就是丽春红染色不如考马斯亮蓝灵敏，只能染出丰度高的蛋白。你的marker也要上很多才可以看得。你可以用prestained的marker，就不用预染直接 ...

要多上几次Marker啊。。。预染的好贵，肉疼，但是试试看吧，谢谢啊
赞一下 回复此楼
7楼2012-10-18 09:07:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
shenxing325: 金币+2 2012-10-18 09:38:12
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-18 18:46:13
引用回帖:
6楼: Originally posted by shenxing325 at 2012-10-18 09:05:44
可以可以传授一下你们做20kD蛋白的经验呢？比如说转膜电流多大，多长时间之类的...

我用的湿转是400mA转1-1.5小时。如果大的疏水性蛋白，可以转2h。
老式的半干转移要根据胶和膜的面积（平方厘米）计算电流（mA）。新买的有些仪器可以电流可以上到1-2A，10分钟就够了。
赞一下 回复此楼
8楼2012-10-18 09:22:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-18 09:22:08
我用的湿转是400mA转1-1.5小时。如果大的疏水性蛋白，可以转2h。
老式的半干转移要根据胶和膜的面积（平方厘米）计算电流（mA）。新买的有些仪器可以电流可以上到1-2A，10分钟就够了。...

这么长时间都不会转过吗？我之前做的40多kD的蛋白，用200mA，1.5个小时转的效果就挺好的，所以我做20kD的这个用的是1个小时，但是就没转上。。。所以这次换了0.22的膜，打算做45min
赞一下 回复此楼
9楼2012-10-18 09:37:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by shenxing325 at 2012-10-18 09:37:49
这么长时间都不会转过吗？我之前做的40多kD的蛋白，用200mA，1.5个小时转的效果就挺好的，所以我做20kD的这个用的是1个小时，但是就没转上。。。所以这次换了0.22的膜，打算做45min...

你用的是PVDF膜吗？不会转过的，NC膜的话不好说。
赞一下 回复此楼
10楼2012-10-18 11:33:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 shenxing325 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料专硕306英一数二 +4 z1z2z3879 2026-03-16 6/300 2026-03-16 19:38 by z1z2z3879
[考研] 环境工程调剂 +6 大可digkids 2026-03-16 6/300 2026-03-16 17:16 by barlinike
[考研] 0703化学调剂 ，六级已过，有科研经历 +7 曦熙兮 2026-03-15 7/350 2026-03-16 16:34 by houyaoxu
[考研] 290求调剂 +5 孔志浩 2026-03-12 10/500 2026-03-16 09:01 by 余晖&
[考研] 326求调剂 +3 mlpqaz03 2026-03-15 3/150 2026-03-16 07:33 by Iveryant
[考研] 0856专硕279求调剂 +5 加油加油！? 2026-03-15 5/250 2026-03-15 11:58 by 2020015
[考研] 288求调剂 +4 奇点0314 2026-03-14 4/200 2026-03-14 23:04 by JourneyLucky
[考研] 297一志愿上交085600求调剂 +5 指尖八千里 2026-03-14 5/250 2026-03-14 17:26 by a不易
[考研] 265求调剂 +4 威化饼07 2026-03-12 4/200 2026-03-14 17:23 by userper
[考研] 328求调剂 +3 5201314Lsy！ 2026-03-13 6/300 2026-03-14 15:31 by hyswxzs
[考研] 331求调剂（0703有机化学 +5 ZY-05 2026-03-13 6/300 2026-03-14 10:51 by Jy?
[考研] 求调剂，一志愿江南大学环境工程085701 +3 Djdjj12 2026-03-10 4/200 2026-03-14 00:31 by JourneyLucky
[考研] 337一志愿华南理工0805材料求调剂 +7 mysdl 2026-03-11 9/450 2026-03-13 22:43 by JourneyLucky
[考研] 308求调剂 +5 是Lupa啊 2026-03-11 5/250 2026-03-13 22:13 by JourneyLucky
[考研] 332求调剂 +3 Zz版 2026-03-13 3/150 2026-03-13 20:36 by 18595523086
[考研] 290求调剂 +7 ADT 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:17 by JourneyLucky
[考研] 085600材料与化工 309分请求调剂 +7 dtdxzxx 2026-03-12 8/400 2026-03-13 14:43 by jxchenghu
[考研] 321求调剂（食品/专硕） +3 xc321 2026-03-12 6/300 2026-03-13 08:45 by xc321
[考研] 420求调剂 +4 莫向外求11 2026-03-10 6/300 2026-03-12 14:41 by ruiyingmiao
[考研] 研究生招生 +3 徐海涛11 2026-03-10 7/350 2026-03-12 14:26 by 徐海涛11
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭