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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请问20多kD的蛋白做Western可不可以用湿转？另外需要注意些什么？
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shenxing325

铜虫 (小有名气)

[求助] 请问20多kD的蛋白做Western可不可以用湿转？另外需要注意些什么？

如题，做了两次Western了，第二次做的时候用立春红染色的时候感觉条带看到了一些，但是结果还是没有条带，预染Marker也不清晰。这次打算用0.22um的膜来做，不知道结果会不会好一些。按理来说小分子应该用半干法，但是操作全是自己摸索的，不大会弄。半干法因为没有海绵的关系，感觉三明治貌似夹不紧啊，是不是滤纸要加多点加到很厚才行呢？请大家帮忙说说自己的经验
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1楼 2012-10-17 21:34:40
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royxueli

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by novodavid at 2012-10-18 09:01:48
求问你们的湿转条件？我需要转15KD的蛋白，以前是半干，反而不是很好。你们的电流，电压，时间，滤纸层数是多少呢？...

电压是100v。。如果不能恒压就恒流300mA，反正是那个biorad电源的上限了。。上下各两层滤纸，时间是1个小时
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11楼2012-10-19 00:26:42
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
补充一下：另外看到Western的技术手册里说，SDS会阻碍小分子蛋白和膜的结合，但是又说PVDF膜适用于有SDS存在的时候与蛋白质结合。那小分子蛋白用PVDF膜电转液里面到底要不要加SDS呢？加的话浓度多少比较合适？0.04%？0.1%？
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2楼2012-10-17 21:56:31
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royxueli

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-18 18:45:47
20kd的我们都是用的湿转的，效果ok的。。丽春红染色看到的条带基本都是杂带，你要的条带是看不到的。。。。预染的maker看不到？在胶上清不清楚呢？是不是时间不够呢。。buffer没有问题吗。。半干没有做过。。不好意思了。。
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3楼2012-10-18 00:43:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shenxing325: 金币+2, ★有帮助 2012-10-18 09:07:16
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-18 18:45:57
引用回帖:
2楼: Originally posted by shenxing325 at 2012-10-17 21:56:31
补充一下：另外看到Western的技术手册里说，SDS会阻碍小分子蛋白和膜的结合，但是又说PVDF膜适用于有SDS存在的时候与蛋白质结合。那小分子蛋白用PVDF膜电转液里面到底要不要加SDS呢？加的话浓度多少比较合适？0.04% ...

加不加SDS都可以转20kDa的蛋白。加的话，我的protocol里是用0.0375%。还有就是丽春红染色不如考马斯亮蓝灵敏，只能染出丰度高的蛋白。你的marker也要上很多才可以看得。你可以用prestained的marker，就不用预染直接看到了。
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4楼2012-10-18 08:22:57
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novodavid

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by royxueli at 2012-10-18 00:43:11
20kd的我们都是用的湿转的，效果ok的。。丽春红染色看到的条带基本都是杂带，你要的条带是看不到的。。。。预染的maker看不到？在胶上清不清楚呢？是不是时间不够呢。。buffer没有问题吗。。半干没有做过。。不好意 ...

求问你们的湿转条件？我需要转15KD的蛋白，以前是半干，反而不是很好。你们的电流，电压，时间，滤纸层数是多少呢？
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5楼2012-10-18 09:01:48
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by royxueli at 2012-10-18 00:43:11
20kd的我们都是用的湿转的，效果ok的。。丽春红染色看到的条带基本都是杂带，你要的条带是看不到的。。。。预染的maker看不到？在胶上清不清楚呢？是不是时间不够呢。。buffer没有问题吗。。半干没有做过。。不好意 ...

可以可以传授一下你们做20kD蛋白的经验呢？比如说转膜电流多大，多长时间之类的
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6楼2012-10-18 09:05:44
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-18 08:22:57
加不加SDS都可以转20kDa的蛋白。加的话，我的protocol里是用0.0375%。还有就是丽春红染色不如考马斯亮蓝灵敏，只能染出丰度高的蛋白。你的marker也要上很多才可以看得。你可以用prestained的marker，就不用预染直接 ...

要多上几次Marker啊。。。预染的好贵，肉疼，但是试试看吧，谢谢啊
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7楼2012-10-18 09:07:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
shenxing325: 金币+2 2012-10-18 09:38:12
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-18 18:46:13
引用回帖:
6楼: Originally posted by shenxing325 at 2012-10-18 09:05:44
可以可以传授一下你们做20kD蛋白的经验呢？比如说转膜电流多大，多长时间之类的...

我用的湿转是400mA转1-1.5小时。如果大的疏水性蛋白，可以转2h。
老式的半干转移要根据胶和膜的面积（平方厘米）计算电流（mA）。新买的有些仪器可以电流可以上到1-2A，10分钟就够了。
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8楼2012-10-18 09:22:08
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-18 09:22:08
我用的湿转是400mA转1-1.5小时。如果大的疏水性蛋白，可以转2h。
老式的半干转移要根据胶和膜的面积（平方厘米）计算电流（mA）。新买的有些仪器可以电流可以上到1-2A，10分钟就够了。...

这么长时间都不会转过吗？我之前做的40多kD的蛋白，用200mA，1.5个小时转的效果就挺好的，所以我做20kD的这个用的是1个小时，但是就没转上。。。所以这次换了0.22的膜，打算做45min
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9楼2012-10-18 09:37:49
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by shenxing325 at 2012-10-18 09:37:49
这么长时间都不会转过吗？我之前做的40多kD的蛋白，用200mA，1.5个小时转的效果就挺好的，所以我做20kD的这个用的是1个小时，但是就没转上。。。所以这次换了0.22的膜，打算做45min...

你用的是PVDF膜吗？不会转过的，NC膜的话不好说。
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10楼2012-10-18 11:33:17
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