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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请问20多kD的蛋白做Western可不可以用湿转？另外需要注意些什么？
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royxueli

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by novodavid at 2012-10-18 09:01:48
求问你们的湿转条件？我需要转15KD的蛋白，以前是半干，反而不是很好。你们的电流，电压，时间，滤纸层数是多少呢？...

电压是100v。。如果不能恒压就恒流300mA，反正是那个biorad电源的上限了。。上下各两层滤纸，时间是1个小时
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11楼2012-10-19 00:26:42
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-18 11:33:17
你用的是PVDF膜吗？不会转过的，NC膜的话不好说。...

是PVDF膜。这次转膜预染Marker转上了，但是用立春红染色还是木有蛋白条带，可能是染色有问题吧。。。今天能看到结果怎样。。。
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12楼2012-10-19 11:52:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
shenxing325: 金币+1, ★有帮助 2012-10-19 19:59:54
引用回帖:
12楼: Originally posted by shenxing325 at 2012-10-19 11:52:44
是PVDF膜。这次转膜预染Marker转上了，但是用立春红染色还是木有蛋白条带，可能是染色有问题吧。。。今天能看到结果怎样。。。...

如果marker转上了，你的目的蛋白应该没问题。你可以看看marker是不是转完全了。丽春红染不好可能和蛋白的量有关，看不到也不一定没有。再说，一般的Western的灵敏度比染色要高。祝实验成功。
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13楼2012-10-19 12:26:27
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
300mA转1.5小时足够转充分，你也可以适当缩短转膜时间，转完之后把胶染一下看看效果
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14楼2012-10-19 12:56:44
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-19 12:26:27
如果marker转上了，你的目的蛋白应该没问题。你可以看看marker是不是转完全了。丽春红染不好可能和蛋白的量有关，看不到也不一定没有。再说，一般的Western的灵敏度比染色要高。祝实验成功。...

木有成功。。。marker基本都转上了，蛋白应该也转上了，胶都是透明的了。但是立春红染色没有颜色，最后DAB试剂盒染色也没有条带。会不会是标签掉了啊。。。
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15楼2012-10-19 19:59:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
15楼: Originally posted by shenxing325 at 2012-10-19 19:59:41
木有成功。。。marker基本都转上了，蛋白应该也转上了，胶都是透明的了。但是立春红染色没有颜色，最后DAB试剂盒染色也没有条带。会不会是标签掉了啊。。。...

你确定抗体没有问题吗？如果膜转好了的话应该没问题啊。不知道你说是什么标签？你用的标签抗体检测吗？
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16楼2012-10-20 06:36:33
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-20 06:36:33
你确定抗体没有问题吗？如果膜转好了的话应该没问题啊。不知道你说是什么标签？你用的标签抗体检测吗？...

抗体应该没有问题，同一个表达载体，前两天做的一个40多kD的重组蛋白就做出来了，就是普通的His标签啊
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17楼2012-10-20 10:54:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
17楼: Originally posted by shenxing325 at 2012-10-20 10:54:18
抗体应该没有问题，同一个表达载体，前两天做的一个40多kD的重组蛋白就做出来了，就是普通的His标签啊...

有可能是上样量不同。你的样品也是用菌表达的重组蛋白吗，还是其他宿主的His-tagged蛋白？标签不大可能掉的吧，你做的His-tag是可以用酶切掉的吗？
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18楼2012-10-20 11:44:37
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-20 11:44:37
有可能是上样量不同。你的样品也是用菌表达的重组蛋白吗，还是其他宿主的His-tagged蛋白？标签不大可能掉的吧，你做的His-tag是可以用酶切掉的吗？...

嗯，这个也是自己表达的重组蛋白。想想也是，His标签也不大容易掉。。。那就说明，这个不是我要的蛋白？那就悲剧了
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19楼2012-10-21 18:00:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
19楼: Originally posted by shenxing325 at 2012-10-21 18:00:18
嗯，这个也是自己表达的重组蛋白。想想也是，His标签也不大容易掉。。。那就说明，这个不是我要的蛋白？那就悲剧了...

你可以试试用镍柱纯化一下看看。如果能挂柱纯化到的话，起码说明his-tag在上面了，经纯化过的蛋白可以有多种方法进一步鉴定。
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20楼2012-10-21 23:26:26
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