应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请问20多kD的蛋白做Western可不可以用湿转？另外需要注意些什么？
51/1返回列表
查看: 3097  |  回复: 20
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

shenxing325

铜虫 (小有名气)

[求助] 请问20多kD的蛋白做Western可不可以用湿转？另外需要注意些什么？

如题，做了两次Western了，第二次做的时候用立春红染色的时候感觉条带看到了一些，但是结果还是没有条带，预染Marker也不清晰。这次打算用0.22um的膜来做，不知道结果会不会好一些。按理来说小分子应该用半干法，但是操作全是自己摸索的，不大会弄。半干法因为没有海绵的关系，感觉三明治貌似夹不紧啊，是不是滤纸要加多点加到很厚才行呢？请大家帮忙说说自己的经验
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼2012-10-17 21:34:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by royxueli at 2012-10-18 00:43:11
20kd的我们都是用的湿转的，效果ok的。。丽春红染色看到的条带基本都是杂带，你要的条带是看不到的。。。。预染的maker看不到？在胶上清不清楚呢？是不是时间不够呢。。buffer没有问题吗。。半干没有做过。。不好意 ...

可以可以传授一下你们做20kD蛋白的经验呢？比如说转膜电流多大，多长时间之类的
赞一下 回复此楼
6楼2012-10-18 09:05:44
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 21 个回答

shenxing325

铜虫 (小有名气)
补充一下：另外看到Western的技术手册里说，SDS会阻碍小分子蛋白和膜的结合，但是又说PVDF膜适用于有SDS存在的时候与蛋白质结合。那小分子蛋白用PVDF膜电转液里面到底要不要加SDS呢？加的话浓度多少比较合适？0.04%？0.1%？
赞一下 回复此楼
2楼2012-10-17 21:56:31
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

royxueli

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-18 18:45:47
20kd的我们都是用的湿转的，效果ok的。。丽春红染色看到的条带基本都是杂带，你要的条带是看不到的。。。。预染的maker看不到？在胶上清不清楚呢？是不是时间不够呢。。buffer没有问题吗。。半干没有做过。。不好意思了。。
赞一下 回复此楼
3楼2012-10-18 00:43:11
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shenxing325: 金币+2, ★有帮助 2012-10-18 09:07:16
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-18 18:45:57
引用回帖:
2楼: Originally posted by shenxing325 at 2012-10-17 21:56:31
补充一下：另外看到Western的技术手册里说，SDS会阻碍小分子蛋白和膜的结合，但是又说PVDF膜适用于有SDS存在的时候与蛋白质结合。那小分子蛋白用PVDF膜电转液里面到底要不要加SDS呢？加的话浓度多少比较合适？0.04% ...

加不加SDS都可以转20kDa的蛋白。加的话，我的protocol里是用0.0375%。还有就是丽春红染色不如考马斯亮蓝灵敏，只能染出丰度高的蛋白。你的marker也要上很多才可以看得。你可以用prestained的marker，就不用预染直接看到了。
赞一下 回复此楼
4楼2012-10-18 08:22:57
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 21 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭