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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 连接克隆载体提取质粒结果跑出两条带
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张冰宝

新虫 (小有名气)

[求助] 连接克隆载体提取质粒结果跑出两条带 已有6人参与

最近在做质粒的构建，将目地片段连接到pmd-18t中。连了很多次，每次16度连接过夜，后转化到感受态细胞中，挑菌过夜后进行菌液pcr，每次都有很多杂带出现，目的条带也不是很亮。于是提质粒鉴定，提出的质粒是两条带，一条带大小是我的目的条带，一条带大小是我的载体条带。好几次都是这种结果。不知道是什么原因？
1：为什么提取质粒的条带与双酶切的跑胶结果是一样的呢？这说明我是连接上了还是没连接上啊？
2：如果没有连接上，连接的是空载体，不是应该只有空载体的一个带吗？大小在2600bp处。为什么还会有我的目的条带呢？
3：如果连接上了，提的质粒应该不能把载体和片段断开吧？
实在是不知道怎么回事？请高手帮帮忙分析一下。十万火急
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1楼 2014-11-03 15:22:44
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jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-03 18:04:02
请上传图片看看，以便更好的分析结果。。
顺便说下，质粒跑电泳是有2条带的。
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学习再学习，努力再努力。
2楼2014-11-03 16:27:47
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jian212 at 2014-11-03 16:27:47
请上传图片看看，以便更好的分析结果。。
顺便说下，质粒跑电泳是有2条带的。

图片没保存呀，因为感觉不对。但是我分别用的目的片段的对照和载体的对照，结果显示两条带分别是我的目的片段和载体带。。正常来说我跑出来的质粒大小应该是我的目的片段和载体的片段和呀？
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3楼2014-11-03 17:20:19
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
张冰宝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-05 14:26:53
质粒超螺旋跑的很前面，有可能巧合出现在你的目的基因位置。排除这个原因，做个单酶切

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2014-11-03 21:29:42
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dongdekun

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
张冰宝(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-05 14:27:01
1）正常提取的质粒跑电泳是好几条带的，直接电泳，跟Marker比大小是没有参考性的。
2）如果想看质粒大小（一般没必要），可以单酶切再跑电泳。
3）质粒鉴定一般结合：菌落（液）PCR + 质粒双酶切 + 测序。。。
祝好运。
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5楼2014-11-03 23:29:05
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dongdekun at 2014-11-03 23:29:05
1）正常提取的质粒跑电泳是好几条带的，直接电泳，跟Marker比大小是没有参考性的。
2）如果想看质粒大小（一般没必要），可以单酶切再跑电泳。
3）质粒鉴定一般结合：菌落（液）PCR + 质粒双酶切 + 测序。。。
祝 ...

谢谢你的建议，我已经单酶切上了。一会就能知道结果了
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6楼2014-11-04 09:02:00
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樱桃丸子头

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-11-07 22:45:17
没怎么懂，提取质粒跑出来正常就是不止一条带的呀，理论上有超螺旋，线性，开环三条，但我们一般常见两条，超螺旋和开环的。而且大小不能以简单的碱基数来决定
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7楼2014-11-04 19:12:53
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dongdekun at 2014-11-03 23:29:05
1）正常提取的质粒跑电泳是好几条带的，直接电泳，跟Marker比大小是没有参考性的。
2）如果想看质粒大小（一般没必要），可以单酶切再跑电泳。
3）质粒鉴定一般结合：菌落（液）PCR + 质粒双酶切 + 测序。。。
祝 ...

单酶切证实是空载体。应该是没连上吧
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8楼2014-11-05 08:44:28
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dongdekun

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-11-05 08:44:28
单酶切证实是空载体。应该是没连上吧...

是否使用蓝白斑筛选，白斑比例有多高？
如果菌液PCR非特异扩增多，目的条带不亮，基本上可以判断为假阳性（引物原因除外）？
多挑几个白斑，菌液或者菌落PCR，目的条带很亮的，才用来提质粒酶切或者测序。
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9楼2014-11-05 08:55:30
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by dongdekun at 2014-11-05 08:55:30
是否使用蓝白斑筛选，白斑比例有多高？
如果菌液PCR非特异扩增多，目的条带不亮，基本上可以判断为假阳性（引物原因除外）？
多挑几个白斑，菌液或者菌落PCR，目的条带很亮的，才用来提质粒酶切或者测序。...

恩、我用蓝白斑筛选了，但是只有两个蓝斑，剩下其他都是白斑，一共长了十多个，全都挑了。结果就是假阳性的，已经重新连接了，但是菌板也只长了十个菌落，估计希望不大啊
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10楼2014-11-05 16:01:18
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