应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 连接克隆载体提取质粒结果跑出两条带
121/2返回列表12下一页
查看: 4419  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

张冰宝

新虫 (小有名气)

[求助] 连接克隆载体提取质粒结果跑出两条带 已有6人参与

最近在做质粒的构建，将目地片段连接到pmd-18t中。连了很多次，每次16度连接过夜，后转化到感受态细胞中，挑菌过夜后进行菌液pcr，每次都有很多杂带出现，目的条带也不是很亮。于是提质粒鉴定，提出的质粒是两条带，一条带大小是我的目的条带，一条带大小是我的载体条带。好几次都是这种结果。不知道是什么原因？
1：为什么提取质粒的条带与双酶切的跑胶结果是一样的呢？这说明我是连接上了还是没连接上啊？
2：如果没有连接上，连接的是空载体，不是应该只有空载体的一个带吗？大小在2600bp处。为什么还会有我的目的条带呢？
3：如果连接上了，提的质粒应该不能把载体和片段断开吧？
实在是不知道怎么回事？请高手帮帮忙分析一下。十万火急
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-11-03 15:22:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-03 18:04:02
请上传图片看看，以便更好的分析结果。。
顺便说下，质粒跑电泳是有2条带的。
赞一下 回复此楼
学习再学习，努力再努力。
2楼2014-11-03 16:27:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jian212 at 2014-11-03 16:27:47
请上传图片看看，以便更好的分析结果。。
顺便说下，质粒跑电泳是有2条带的。

图片没保存呀，因为感觉不对。但是我分别用的目的片段的对照和载体的对照，结果显示两条带分别是我的目的片段和载体带。。正常来说我跑出来的质粒大小应该是我的目的片段和载体的片段和呀？
赞一下 回复此楼
3楼2014-11-03 17:20:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
张冰宝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-05 14:26:53
质粒超螺旋跑的很前面，有可能巧合出现在你的目的基因位置。排除这个原因，做个单酶切

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
4楼2014-11-03 21:29:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dongdekun

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
张冰宝(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-05 14:27:01
1）正常提取的质粒跑电泳是好几条带的，直接电泳，跟Marker比大小是没有参考性的。
2）如果想看质粒大小（一般没必要），可以单酶切再跑电泳。
3）质粒鉴定一般结合：菌落（液）PCR + 质粒双酶切 + 测序。。。
祝好运。
赞一下 回复此楼
5楼2014-11-03 23:29:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dongdekun at 2014-11-03 23:29:05
1）正常提取的质粒跑电泳是好几条带的，直接电泳，跟Marker比大小是没有参考性的。
2）如果想看质粒大小（一般没必要），可以单酶切再跑电泳。
3）质粒鉴定一般结合：菌落（液）PCR + 质粒双酶切 + 测序。。。
祝 ...

谢谢你的建议，我已经单酶切上了。一会就能知道结果了
赞一下 回复此楼
6楼2014-11-04 09:02:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

樱桃丸子头

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-11-07 22:45:17
没怎么懂，提取质粒跑出来正常就是不止一条带的呀，理论上有超螺旋，线性，开环三条，但我们一般常见两条，超螺旋和开环的。而且大小不能以简单的碱基数来决定
赞一下 回复此楼
7楼2014-11-04 19:12:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dongdekun at 2014-11-03 23:29:05
1）正常提取的质粒跑电泳是好几条带的，直接电泳，跟Marker比大小是没有参考性的。
2）如果想看质粒大小（一般没必要），可以单酶切再跑电泳。
3）质粒鉴定一般结合：菌落（液）PCR + 质粒双酶切 + 测序。。。
祝 ...

单酶切证实是空载体。应该是没连上吧
赞一下 回复此楼
8楼2014-11-05 08:44:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dongdekun

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-11-05 08:44:28
单酶切证实是空载体。应该是没连上吧...

是否使用蓝白斑筛选，白斑比例有多高？
如果菌液PCR非特异扩增多，目的条带不亮，基本上可以判断为假阳性（引物原因除外）？
多挑几个白斑，菌液或者菌落PCR，目的条带很亮的，才用来提质粒酶切或者测序。
赞一下 回复此楼
9楼2014-11-05 08:55:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by dongdekun at 2014-11-05 08:55:30
是否使用蓝白斑筛选，白斑比例有多高？
如果菌液PCR非特异扩增多，目的条带不亮，基本上可以判断为假阳性（引物原因除外）？
多挑几个白斑，菌液或者菌落PCR，目的条带很亮的，才用来提质粒酶切或者测序。...

恩、我用蓝白斑筛选了，但是只有两个蓝斑，剩下其他都是白斑，一共长了十多个，全都挑了。结果就是假阳性的，已经重新连接了，但是菌板也只长了十个菌落，估计希望不大啊
赞一下 回复此楼
10楼2014-11-05 16:01:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 张冰宝 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 考研化学学硕调剂，一志愿985 +3 张vvvv 2026-03-15 5/250 2026-03-16 20:25 by 张vvvv
[考研] 环境工程调剂 +6 大可digkids 2026-03-16 6/300 2026-03-16 17:16 by barlinike
[考研] 一志愿211 0703方向310分求调剂 +3 努力奋斗112 2026-03-15 3/150 2026-03-16 16:44 by houyaoxu
[考研] 材料与化工求调剂 +3 为学666 2026-03-16 3/150 2026-03-16 15:09 by 加号+
[考研] 326求调剂 +4 上岸的小葡 2026-03-15 5/250 2026-03-16 08:39 by Linda Hu
[考研] 327求调剂 +6 拾光任染 2026-03-15 11/550 2026-03-15 22:47 by 拾光任染
[考博] 欢迎申博同学联系 +3 天道酬勤2026686 2026-03-10 7/350 2026-03-15 19:03 by 天道酬勤2026686
[考研] 085601材料工程315分求调剂 +3 yang_0104 2026-03-15 3/150 2026-03-15 10:58 by peike
[考研] 330求调剂 +3 ?酱给调剂跪了 2026-03-13 3/150 2026-03-14 10:13 by JourneyLucky
[考研] 调剂 +3 13853210211 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:47 by JourneyLucky
[考研] 招收0805（材料）调剂 +3 18595523086 2026-03-13 3/150 2026-03-14 00:33 by 123%、
[考研] 332求调剂 +3 zjy101327 2026-03-11 6/300 2026-03-13 22:48 by JourneyLucky
[考研] 材料工程调剂 +9 咪咪空空 2026-03-12 9/450 2026-03-13 22:05 by 星空星月
[考研] 求材料调剂 085600英一数二总分302 前三科235 精通机器学习 一志愿哈工大 +4 林yaxin 2026-03-12 4/200 2026-03-13 22:04 by 星空星月
[考研] 26调剂/材料/英一数二/总分289/已过A区线 +6 步川酷紫123 2026-03-13 6/300 2026-03-13 21:59 by 星空星月
[考研] （081700）化学工程与技术-298分求调剂 +12 11啦啦啦 2026-03-11 35/1750 2026-03-13 21:25 by JourneyLucky
[考研] 290求调剂 +7 ADT 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:17 by JourneyLucky
[考研] 277求调剂 +4 anchor17 2026-03-12 4/200 2026-03-13 11:15 by 白夜悠长
[考研] 333求调剂 +3 152697 2026-03-12 4/200 2026-03-13 07:08 by Iveryant
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +3 崔wj 2026-03-12 4/200 2026-03-12 19:33 by 求调剂zz
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭