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张冰宝

新虫 (小有名气)

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[求助] 连接克隆载体提取质粒结果跑出两条带已有6人参与

最近在做质粒的构建，将目地片段连接到pmd-18t中。连了很多次，每次16度连接过夜，后转化到感受态细胞中，挑菌过夜后进行菌液pcr，每次都有很多杂带出现，目的条带也不是很亮。于是提质粒鉴定，提出的质粒是两条带，一条带大小是我的目的条带，一条带大小是我的载体条带。好几次都是这种结果。不知道是什么原因？
1：为什么提取质粒的条带与双酶切的跑胶结果是一样的呢？这说明我是连接上了还是没连接上啊？
2：如果没有连接上，连接的是空载体，不是应该只有空载体的一个带吗？大小在2600bp处。为什么还会有我的目的条带呢？
3：如果连接上了，提的质粒应该不能把载体和片段断开吧？
实在是不知道怎么回事？请高手帮帮忙分析一下。十万火急

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1楼2014-11-03 15:22:44

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张冰宝

新虫 (小有名气)

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引用回帖:

9楼: Originally posted by dongdekun at 2014-11-05 08:55:30
是否使用蓝白斑筛选，白斑比例有多高？
如果菌液PCR非特异扩增多，目的条带不亮，基本上可以判断为假阳性（引物原因除外）？
多挑几个白斑，菌液或者菌落PCR，目的条带很亮的，才用来提质粒酶切或者测序。...

恩、我用蓝白斑筛选了，但是只有两个蓝斑，剩下其他都是白斑，一共长了十多个，全都挑了。结果就是假阳性的，已经重新连接了，但是菌板也只长了十个菌落，估计希望不大啊