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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 3`RACE不出带的原因已有2人参与

各位虫友:我现在想用3‘RACE拿一个基因的3’末端,我用的引物是我做荧光定量的引物和带接头的oligo-dt来做拼成一对扩的,现在是退火温度高的话不出带,而退火温度低的话就弥散,看不清具体的带。用toughdown程序也不理想,有同样的问题,我也用过67,64,61,58,55,52的温度梯度,也有同样的温度。我觉得我用的是特异引物,应该比较好扩,但就是没有明显的带,这是为什么啊?求大神解答啊。
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fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-09-26 12:22:16
lwk5716: 金币+4, ★★★很有帮助, 谢谢! 2014-09-26 15:34:18
荧光定量引物是不可以的、应该重新设计上游引物。不知道你用的是哪个试剂盒,试剂盒说明书都带有相应的设计引物的TM值(一般要求较高,可以减少特异扩增)要求,因为接头引物的TM值就高,荧光定量的引物TM值应该偏低,一对引物的TM值相差太大的话就跑不出条带了
2楼2014-09-26 08:01:56
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fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by lwk5716 at 2014-09-26 15:46:12
我没用试剂盒,用的全式金的反转录酶加上一个做genefish的带接头的oligodt扩的。...

那你可以用软件算一下接头引物的TM值啊
4楼2014-09-26 16:22:33
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fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lwk5716: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-10-02 11:29:37
引用回帖:
8楼: Originally posted by lwk5716 at 2014-09-30 22:38:54
我的接头Tm值65度左右,上游引物接近58度。...

差距有点大(但不是绝对的),建议重新设计引物,最好是设计巢氏引物,第一轮用高保真酶跑,第二轮可以用LA或Ex Taq跑
9楼2014-10-01 17:30:52
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-09-26 08:01:56
荧光定量引物是不可以的、应该重新设计上游引物。不知道你用的是哪个试剂盒,试剂盒说明书都带有相应的设计引物的TM值(一般要求较高,可以减少特异扩增)要求,因为接头引物的TM值就高,荧光定量的引物TM值应该偏低 ...

我没用试剂盒,用的全式金的反转录酶加上一个做genefish的带接头的oligodt扩的。
3楼2014-09-26 15:46:12
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-09-26 16:22:33
那你可以用软件算一下接头引物的TM值啊...

嗯,好的。
5楼2014-09-27 08:35:02
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laojiu9878

至尊木虫 (知名作家)

九牛

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lwk5716: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-09-28 18:16:39
注意引物的正确与否,
但愿人长久
6楼2014-09-28 14:50:50
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by laojiu9878 at 2014-09-28 14:50:50
注意引物的正确与否,

应该是对的,谢谢。
7楼2014-09-28 18:16:21
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-09-26 16:22:33
那你可以用软件算一下接头引物的TM值啊...

我的接头Tm值65度左右,上游引物接近58度。
8楼2014-09-30 22:38:54
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-10-01 17:30:52
差距有点大(但不是绝对的),建议重新设计引物,最好是设计巢氏引物,第一轮用高保真酶跑,第二轮可以用LA或Ex Taq跑...

谢谢你的回答!
10楼2014-10-02 11:37:47
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