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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 3`RACE不出带的原因
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 3`RACE不出带的原因 已有2人参与

各位虫友:我现在想用3‘RACE拿一个基因的3’末端，我用的引物是我做荧光定量的引物和带接头的oligo-dt来做拼成一对扩的，现在是退火温度高的话不出带，而退火温度低的话就弥散，看不清具体的带。用toughdown程序也不理想，有同样的问题，我也用过67，64，61，58，55，52的温度梯度，也有同样的温度。我觉得我用的是特异引物，应该比较好扩，但就是没有明显的带，这是为什么啊？求大神解答啊。
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1楼 2014-09-25 23:56:45
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fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lwk5716: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-10-02 11:29:37
引用回帖:
8楼: Originally posted by lwk5716 at 2014-09-30 22:38:54
我的接头Tm值65度左右，上游引物接近58度。...

差距有点大（但不是绝对的），建议重新设计引物，最好是设计巢氏引物，第一轮用高保真酶跑，第二轮可以用LA或Ex Taq跑
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9楼2014-10-01 17:30:52
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fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-26 12:22:16
lwk5716: 金币+4, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2014-09-26 15:34:18
荧光定量引物是不可以的、应该重新设计上游引物。不知道你用的是哪个试剂盒，试剂盒说明书都带有相应的设计引物的TM值（一般要求较高，可以减少特异扩增）要求，因为接头引物的TM值就高，荧光定量的引物TM值应该偏低，一对引物的TM值相差太大的话就跑不出条带了
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2楼2014-09-26 08:01:56
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-09-26 08:01:56
荧光定量引物是不可以的、应该重新设计上游引物。不知道你用的是哪个试剂盒，试剂盒说明书都带有相应的设计引物的TM值（一般要求较高，可以减少特异扩增）要求，因为接头引物的TM值就高，荧光定量的引物TM值应该偏低 ...

我没用试剂盒，用的全式金的反转录酶加上一个做genefish的带接头的oligodt扩的。
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3楼2014-09-26 15:46:12
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fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by lwk5716 at 2014-09-26 15:46:12
我没用试剂盒，用的全式金的反转录酶加上一个做genefish的带接头的oligodt扩的。...

那你可以用软件算一下接头引物的TM值啊
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4楼2014-09-26 16:22:33
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