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青青草allan

银虫 (小有名气)

[求助] 3端RACE换了两次引物了，扩出来的都是同一种病毒，求高手给指点一下，不胜感激！

最近做一个基因的全长，3端RACE扩出来的条带经切胶回收，克隆后测序，Blast相似度高的是一种病毒，换了两次引物了，都是同一种病毒，这个病毒是我们研究的这个昆虫体内的一种特有病毒。这种结果，应该是引物不好，特异性扩增了，但我不解的是：为什么两次不同的引物恰好扩的都是这个病毒？难道是这个病毒的基因整合到昆虫体内了？求高手给指点一下，不胜感激！迷茫了，做了好久的RACE，快失去信心了！
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爱出者爱返，福往者福来
1楼 2014-08-30 10:50:06
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喜气洋洋

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
青青草allan: 金币+2, ★有帮助 2014-08-31 10:23:04
是昆虫杆状病毒吗？

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学海无涯懂做舟
2楼2014-08-30 20:58:42
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gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
青青草allan: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-31 10:21:45
做RACE的时候建议做巢式PCR来增强特异性
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3楼2014-08-30 23:07:43
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gastrodia at 2014-08-30 23:07:43
做RACE的时候建议做巢式PCR来增强特异性

你用的也是clontech的试剂盒吗？做巢时PCR的时候，除了用试剂盒里提供的Nested Universal Primer A之外，自己还要设一条引物吗？还是用首次PCR所用的3‘或5‘RACE引物就行？
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爱出者爱返，福往者福来
4楼2014-08-31 10:21:14
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 喜气洋洋 at 2014-08-30 20:58:42
是昆虫杆状病毒吗？

不是，是昆虫的一种RNA病毒。
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爱出者爱返，福往者福来
5楼2014-08-31 10:22:46
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gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
青青草allan: 金币+5 2014-08-31 10:57:17
青青草allan: 金币+18 2014-08-31 10:57:32
你自己的特意性引物，在外侧引物里面再设计一条，通用引物用他的，将第一次PCR的结果稀释100倍取1微升作为模版使用内侧引物（最好和外侧引物间隔200bp左右，跑胶的时候好检测）和通用引物（Smart RACE里面有一条短的）进行第二轮PCR
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6楼2014-08-31 10:38:19
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gastrodia at 2014-08-31 10:38:19
你自己的特意性引物，在外侧引物里面再设计一条，通用引物用他的，将第一次PCR的结果稀释100倍取1微升作为模版使用内侧引物（最好和外侧引物间隔200bp左右，跑胶的时候好检测）和通用引物（Smart RACE里面有一条短的 ...

意思是第一次PCR时所用的特异性引物（自己根据已做出来的片段设计的3‘或5‘RACE引物）算是外侧引物，第二次PCR时需要设计一条和外侧引物间隔200bp左右的内侧引物？这个内侧引物设计原则是和外侧引物一样的吧？你QQ多少？能否加下好友？
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爱出者爱返，福往者福来
7楼2014-08-31 10:57:02
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gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
青青草allan: 金币+2, ★有帮助 2014-09-01 10:19:33
根据已有的序列设计2条特异性的3‘RACE引物，一个在外，一个在内，
        外侧引物                         内侧引物
     ——————                      ——————                                 RACE反向引物
—————————————————————————（已知序列）
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8楼2014-08-31 21:30:19
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gastrodia at 2014-08-31 21:30:19
根据已有的序列设计2条特异性的3‘RACE引物，一个在外，一个在内，
        外侧引物                         内侧引物
     ——————                      ——————                                  ...

好的，谢谢了！
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爱出者爱返，福往者福来
9楼2014-09-01 10:19:19
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gastrodia at 2014-08-31 10:38:19
你自己的特意性引物，在外侧引物里面再设计一条，通用引物用他的，将第一次PCR的结果稀释100倍取1微升作为模版使用内侧引物（最好和外侧引物间隔200bp左右，跑胶的时候好检测）和通用引物（Smart RACE里面有一条短的 ...

为啥通用引物不用长和短一起啊？而是只用短的

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10楼2016-06-09 21:25:52
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