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青青草allan

银虫 (小有名气)

[求助] 3端RACE换了两次引物了,扩出来的都是同一种病毒,求高手给指点一下,不胜感激!

最近做一个基因的全长,3端RACE扩出来的条带经切胶回收,克隆后测序,Blast相似度高的是一种病毒,换了两次引物了,都是同一种病毒,这个病毒是我们研究的这个昆虫体内的一种特有病毒。这种结果,应该是引物不好,特异性扩增了,但我不解的是:为什么两次不同的引物恰好扩的都是这个病毒?难道是这个病毒的基因整合到昆虫体内了?求高手给指点一下,不胜感激!迷茫了,做了好久的RACE,快失去信心了!
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喜气洋洋

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
青青草allan: 金币+2, 有帮助 2014-08-31 10:23:04
是昆虫杆状病毒吗?

[ 发自小木虫客户端 ]
学海无涯懂做舟
2楼2014-08-30 20:58:42
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gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
青青草allan: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-31 10:21:45
做RACE的时候建议做巢式PCR来增强特异性
3楼2014-08-30 23:07:43
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青青草allan

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by gastrodia at 2014-08-30 23:07:43
做RACE的时候建议做巢式PCR来增强特异性

你用的也是clontech的试剂盒吗?做巢时PCR的时候,除了用试剂盒里提供的Nested Universal Primer A之外,自己还要设一条引物吗?还是用首次PCR所用的3‘或5‘RACE引物就行?
爱出者爱返,福往者福来
4楼2014-08-31 10:21:14
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青青草allan

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 喜气洋洋 at 2014-08-30 20:58:42
是昆虫杆状病毒吗?

不是,是昆虫的一种RNA病毒。
爱出者爱返,福往者福来
5楼2014-08-31 10:22:46
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gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
青青草allan: 金币+5 2014-08-31 10:57:17
青青草allan: 金币+18 2014-08-31 10:57:32
你自己的特意性引物,在外侧引物里面再设计一条,通用引物用他的,将第一次PCR的结果稀释100倍取1微升作为模版使用内侧引物(最好和外侧引物间隔200bp左右,跑胶的时候好检测)和通用引物(Smart RACE里面有一条短的)进行第二轮PCR
6楼2014-08-31 10:38:19
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青青草allan

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by gastrodia at 2014-08-31 10:38:19
你自己的特意性引物,在外侧引物里面再设计一条,通用引物用他的,将第一次PCR的结果稀释100倍取1微升作为模版使用内侧引物(最好和外侧引物间隔200bp左右,跑胶的时候好检测)和通用引物(Smart RACE里面有一条短的 ...

意思是第一次PCR时所用的特异性引物(自己根据已做出来的片段设计的3‘或5‘RACE引物)算是外侧引物,第二次PCR时需要设计一条和外侧引物间隔200bp左右的内侧引物?这个内侧引物设计原则是和外侧引物一样的吧?你QQ多少?能否加下好友?
爱出者爱返,福往者福来
7楼2014-08-31 10:57:02
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gastrodia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
青青草allan: 金币+2, 有帮助 2014-09-01 10:19:33
根据已有的序列设计2条特异性的3‘RACE引物,一个在外,一个在内,
        外侧引物                         内侧引物
     ——————                      ——————                                 RACE反向引物
—————————————————————————(已知序列)
8楼2014-08-31 21:30:19
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青青草allan

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by gastrodia at 2014-08-31 21:30:19
根据已有的序列设计2条特异性的3‘RACE引物,一个在外,一个在内,
        外侧引物                         内侧引物
     ——————                      ——————                                  ...

好的,谢谢了!
爱出者爱返,福往者福来
9楼2014-09-01 10:19:19
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

引用回帖:
6楼: Originally posted by gastrodia at 2014-08-31 10:38:19
你自己的特意性引物,在外侧引物里面再设计一条,通用引物用他的,将第一次PCR的结果稀释100倍取1微升作为模版使用内侧引物(最好和外侧引物间隔200bp左右,跑胶的时候好检测)和通用引物(Smart RACE里面有一条短的 ...

为啥通用引物不用长和短一起啊?而是只用短的

发自小木虫Android客户端
10楼2016-06-09 21:25:52
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