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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

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[求助] 3`RACE不出带的原因已有2人参与

各位虫友:我现在想用3‘RACE拿一个基因的3’末端，我用的引物是我做荧光定量的引物和带接头的oligo-dt来做拼成一对扩的，现在是退火温度高的话不出带，而退火温度低的话就弥散，看不清具体的带。用toughdown程序也不理想，有同样的问题，我也用过67，64，61，58，55，52的温度梯度，也有同样的温度。我觉得我用的是特异引物，应该比较好扩，但就是没有明显的带，这是为什么啊？求大神解答啊。

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1楼2014-09-25 23:56:45

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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

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引用回帖:

2楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-09-26 08:01:56
荧光定量引物是不可以的、应该重新设计上游引物。不知道你用的是哪个试剂盒，试剂盒说明书都带有相应的设计引物的TM值（一般要求较高，可以减少特异扩增）要求，因为接头引物的TM值就高，荧光定量的引物TM值应该偏低 ...

我没用试剂盒，用的全式金的反转录酶加上一个做genefish的带接头的oligodt扩的。