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pursuream

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 质粒双酶切 多条带 已有1人参与

最近一直在纠结于在用于绿脓杆菌表达的载体pMMB67EH上做构建,质粒空载有8800bp。用EcoRI、HindIII双酶切,每次都切出至少两条带。分别回收了做连接从未成功,负对照也没长过点。同样的酶不管是不是HF,切其它质粒都正常。求问,两条亮带,那条靠谱些?有什么改进方案么?多谢!如果有谁搞过这个质粒,或者知道其他的绿脓杆菌表达质粒就太好了。


不是时间过久的问题,二十五分钟就切成这样了:
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永远一片天

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
pursuream: 金币+5, 有帮助 2014-10-17 09:48:07
我觉得你这个没有多大问题,只要你选择正确的条带切胶纯化,然后进行连接转化就可以了,你这个量有点少,建议一次量多点,不然切胶后纯化的量很少,影响后续连接~
2楼2014-10-17 09:20:58
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pursuream

至尊木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 永远一片天 at 2014-10-17 09:20:58
我觉得你这个没有多大问题,只要你选择正确的条带切胶纯化,然后进行连接转化就可以了,你这个量有点少,建议一次量多点,不然切胶后纯化的量很少,影响后续连接~

谢谢你!终于有人鸟我。
但实际上我两条带都试过,始终没做出来,条带一直不正常,上次很认真地新提的空载质粒酶切后下面2.5kb还有明显的亮带。已经尽量避免星号活性了。搞得整个人都不好,对连接体系都没有信心了。
打算用重组kit做了。
3楼2014-10-17 09:55:14
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zoujin09

铜虫 (初入文坛)

请问你这个问题最后解决了吗?我现在也做这个质粒,跟你一样的问题

发自小木虫IOS客户端
4楼2017-10-31 17:23:45
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