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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒双酶切 多条带
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pursuream

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 质粒双酶切 多条带 已有1人参与

最近一直在纠结于在用于绿脓杆菌表达的载体pMMB67EH上做构建，质粒空载有8800bp。用EcoRI、HindIII双酶切，每次都切出至少两条带。分别回收了做连接从未成功，负对照也没长过点。同样的酶不管是不是HF，切其它质粒都正常。求问，两条亮带，那条靠谱些？有什么改进方案么？多谢！如果有谁搞过这个质粒，或者知道其他的绿脓杆菌表达质粒就太好了。


不是时间过久的问题，二十五分钟就切成这样了：
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1楼 2014-09-17 19:36:01
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pursuream

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 永远一片天 at 2014-10-17 09:20:58
我觉得你这个没有多大问题，只要你选择正确的条带切胶纯化，然后进行连接转化就可以了，你这个量有点少，建议一次量多点，不然切胶后纯化的量很少，影响后续连接~

谢谢你！终于有人鸟我。
但实际上我两条带都试过，始终没做出来，条带一直不正常，上次很认真地新提的空载质粒酶切后下面2.5kb还有明显的亮带。已经尽量避免星号活性了。搞得整个人都不好，对连接体系都没有信心了。
打算用重组kit做了。
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3楼2014-10-17 09:55:14
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永远一片天

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
pursuream: 金币+5, ★有帮助 2014-10-17 09:48:07
我觉得你这个没有多大问题，只要你选择正确的条带切胶纯化，然后进行连接转化就可以了，你这个量有点少，建议一次量多点，不然切胶后纯化的量很少，影响后续连接~
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2楼2014-10-17 09:20:58
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zoujin09

铜虫 (初入文坛)
请问你这个问题最后解决了吗？我现在也做这个质粒，跟你一样的问题

发自小木虫IOS客户端
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4楼2017-10-31 17:23:45
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