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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » NI柱纯化后没有酶活
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林默泪

新虫 (初入文坛)

[求助] NI柱纯化后没有酶活 已有1人参与

我用的是PET28a，在BL21中表达，破碎上清测酶活是有的，过ni柱后，跑蛋白电泳，可以看出基本是目的蛋白，但是，酶活基本上可以说是没有。
求高手指点下~~
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1楼 2014-08-21 10:59:16
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zero19871029

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
林默泪(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-21 15:33:22
林默泪: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢~~ 2014-08-22 08:08:40
我也遇到过这种问题，原因很简单，就是镍离子的毒害作用，洗脱蛋白的时候镍离子也残留在溶液中，要保持蛋白活性的话最好透析浓缩一下，另外罗氏再卖一款镍柱是免毒害的，没用过不知道好不好用
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2楼2014-08-21 14:34:03
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summerliehu

银虫 (小有名气)
请问一下你破碎的上清是怎么测的酶活？
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★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★欢迎访问【时间管理】版————管理时间，走向成功★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★
3楼2014-08-21 14:42:53
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林默泪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by summerliehu at 2014-08-21 14:42:53
请问一下你破碎的上清是怎么测的酶活？

与底物反应会产生丙酮酸，然后丙酮酸和2，4-二硝基苯肼反应在碱性条件下会有棕红色的产物，然后测吸光度和标准曲线来计算。
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4楼2014-08-22 08:12:30
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君扬1989

铁杆木虫 (著名写手)
请问 我的蛋白表达量不是很高，您在表达蛋白时，所用的条件是如何的？还有，我的蛋白纯化后，条带不是单一的，这种情况如何处理？谢谢~
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5楼2014-08-22 09:53:09
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林默泪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 君扬1989 at 2014-08-22 09:53:09
请问 我的蛋白表达量不是很高，您在表达蛋白时，所用的条件是如何的？还有，我的蛋白纯化后，条带不是单一的，这种情况如何处理？谢谢~

37度培养4小时后，IPTG（0.5mM）30度诱导9小时。
纯化的时候，梯度洗脱测试下。然后每个梯度（50,100,200,250,300,400等）的样跑个电泳。我是用5mM咪唑平衡，20咪唑可以洗下大部分杂蛋白，然后50mM咪唑再洗下剩下的大部分杂蛋白。然后200mM咪唑洗脱，这样就差不多纯了。不过我自己的柱子好像已经不太好用了，吸附量不高，我用别人的用过，还是不错的。
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6楼2014-08-26 09:02:53
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君扬1989

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 林默泪 at 2014-08-26 09:02:53
37度培养4小时后，IPTG（0.5mM）30度诱导9小时。
纯化的时候，梯度洗脱测试下。然后每个梯度（50,100,200,250,300,400等）的样跑个电泳。我是用5mM咪唑平衡，20咪唑可以洗下大部分杂蛋白，然后50mM咪唑再洗下剩下 ...

好 非常感谢 我试试~
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7楼2014-08-26 16:19:40
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