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林默泪

新虫 (初入文坛)

[求助] NI柱纯化后没有酶活 已有1人参与

我用的是PET28a,在BL21中表达,破碎上清测酶活是有的,过ni柱后,跑蛋白电泳,可以看出基本是目的蛋白,但是,酶活基本上可以说是没有。
求高手指点下~~
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summerliehu

银虫 (小有名气)

请问一下你破碎的上清是怎么测的酶活?
★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★欢迎访问【时间管理】版————管理时间,走向成功★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★
3楼2014-08-21 14:42:53
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zero19871029

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
林默泪(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-21 15:33:22
林默泪: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢~~ 2014-08-22 08:08:40
我也遇到过这种问题,原因很简单,就是镍离子的毒害作用,洗脱蛋白的时候镍离子也残留在溶液中,要保持蛋白活性的话最好透析浓缩一下,另外罗氏再卖一款镍柱是免毒害的,没用过不知道好不好用
2楼2014-08-21 14:34:03
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林默泪

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by summerliehu at 2014-08-21 14:42:53
请问一下你破碎的上清是怎么测的酶活?

与底物反应会产生丙酮酸,然后丙酮酸和2,4-二硝基苯肼反应在碱性条件下会有棕红色的产物,然后测吸光度和标准曲线来计算。
4楼2014-08-22 08:12:30
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君扬1989

铁杆木虫 (著名写手)

请问 我的蛋白表达量不是很高,您在表达蛋白时,所用的条件是如何的?还有,我的蛋白纯化后,条带不是单一的,这种情况如何处理?谢谢~
5楼2014-08-22 09:53:09
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