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小二丫结婚金虫 (初入文坛)
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大肠杆菌基因工程菌表达的L-门冬酰胺酶纯化及酶活测定方法，求指点！已有1人参与
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| 本人构建了一株大肠杆菌基因工程菌，诱导后用于发酵产L-门冬酰胺酶（原设计是胞外表达），我是直接将发酵液挂Ni柱子纯化蛋白（有组氨酸标签），用诱导前发酵液、诱导后发酵液、纯化的目的蛋白同时跑电泳，结果没看到目的蛋白分子量大小的条带。还有，将发酵液离心后的上清液和菌体洗涤后悬浮再破壁的溶液同时测酶活（奈斯勒试剂显色法：1ml0.04M的天冬酰胺底物加1ml0.02MpH=8的磷酸盐缓冲液，37度水浴5min预热后，加入粗酶液500ul37度反应15min后，加入1ml50%的三氯乙酸终止反应。再从终止管里取500ul加到3.5ml蒸馏水中，加入1ml奈斯勒试剂显色15min，500nm处测OD值），结果值很低；在测OD值之前我将浑浊的反应液都离心过了，加入奈斯勒试剂后明明看到颜色变得深黄，然后测OD值时却显示很低，实在不知道原因。请各位高手给点建议~~~谢谢 |
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2楼2013-12-09 12:37:31
ruoqiu.xiao
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好吧，看在两朵红花的份儿上，给菇凉示范一遍如何推倒  ，如果菇凉要拿我实践，我是不会拒绝滴 硫酸铵标准品浓度为0.001M，那么铵离子浓度为0.002M。 在显色反应中，菇凉从终止管里取了0.5mL酶水解体系，那么我猜菇凉加硫酸铵标准品的时候应该也是0.5mL，基于该假设， 标准品显色反应中，铵离子物质的量应该为： n(ammonia)=2*10^-3 mole/L*0.5*10^-3 L=1*10^-6 mole=1μmole。 我们再假设，菇凉你的酶水解体系中门冬酰胺酶的浓度恰到好处，以至于从终止管里取出来的0.5mL酶水解体系中也含有1μmole铵，那么在15min的水解反应时间内，平均每min生成的铵的物质的量，或者说水解速率，应改为： Hydrolysis velocity = 1μmole/15min=(1/15) μmole/min 注意水解速率单位是μmole/min，这恰恰也是酶活单位(通常1个单位酶活就是1U)，也就是说，水解速率就是酶活，所以， Asparaginase activity= Hydrolysis velocity=(1/15) μmole/min =(1/15) U (注：通常1个单位酶活就是1U)。 也就是说，从终止管里取出来的0.5mL酶水解体系中含有(1/15) U的门冬酰胺酶，而终止管里原来有3.5mL，所以，终止管里总共含有(7/15) U的门冬酰胺酶。 最开始，菇凉你向终止管里加入了0.5mL粗酶液，那么， 粗酶液的酶活应该为(7/15) U / 0.5ml = (14/15) U/mL。 也就是说，如果菇凉你的粗酶液酶活为(14/15) U/mL，那么显色反应后的读数应该与0.001M硫酸铵标准品显色反应后的读数是一样的，也就是说， 0.001M硫酸铵标准品代表(14/15) U/mL的粗酶液。 求红花  求推倒 各种求 |
8楼2013-12-13 20:50:19
小二丫结婚
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3楼2013-12-09 15:07:44
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【答案】应助回帖
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只说酶活测定方法，我个人的理解： 1. 粗酶液里面有没有含氮有机物啊，菇凉你有木有做空白对照啊(是酶样自己的空白对照，不是标准品的对照)，就是先加三氯乙酸，然后水浴15min，水浴结束后再加粗酶液。 2. 标准品对照问题，硫酸铵标准品浓度多少，A500多少？与酶样A500相比怎么样？ 3. 酶活定义问题，菇凉你是如何定义酶活的 (比如可以定义1min生成1μmole氨定义为1U)？理论上根据硫酸氨标准品浓度和门冬酰胺酶反应时间， 可以计算出硫酸铵标准品代表多少酶活的，这样才能计算你粗酶液的酶活，粗酶液A500低不代表酶活低 4. 奈斯勒试剂是自己配的还是买的碘化汞钾？建议你在测定时候看看A500稳定不稳定，如果用碘化汞钾的话，读数有可能是不太稳定的。 这个是中国药典里面的门冬酰胺酶酶活测定方法： http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6333558&fpage=1 |
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4楼2013-12-10 19:51:27
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5楼2013-12-11 10:43:42
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【答案】应助回帖
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小二丫结婚: 金币+10 2014-03-06 15:20:23
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1. 确定公式里面的倍数关系没搞错？如果你深信自己没搞错，能不能自己推导出来？能不能像推倒男朋友一样熟练地推导公式？比如说，菇凉你知道自己配的0.001M硫酸铵相当于多少单位的酶活吗？ 2. 既然你都发现显色反应不稳定的问题了，那每次测酶活时候为什么不再测定标准品A500 (还是A450？)呢？每次测定数值肯定都会有变化的。 3. 我觉得显色反应不稳定没多大关系，只要能够保证酶样和标准品同时加入奈斯勒试剂，或加入的先后时间间隔不大。如果菇凉你能做到在短时间内加完奈斯勒试剂，接下来在测定A500时候，可以每隔几分钟读一次A500，当然也是在短时间内读完(所以建议用酶标仪，不要用光度计)，然后用每次读数分别去计算酶活，最后你会发现若干次酶活测定结果误差其实不是很大。 |
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6楼2013-12-11 15:35:27
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