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小二丫结婚金虫 (初入文坛)
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[求助]
大肠杆菌基因工程菌表达的L-门冬酰胺酶纯化及酶活测定方法，求指点！ 已有1人参与
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| 本人构建了一株大肠杆菌基因工程菌，诱导后用于发酵产L-门冬酰胺酶（原设计是胞外表达），我是直接将发酵液挂Ni柱子纯化蛋白（有组氨酸标签），用诱导前发酵液、诱导后发酵液、纯化的目的蛋白同时跑电泳，结果没看到目的蛋白分子量大小的条带。还有，将发酵液离心后的上清液和菌体洗涤后悬浮再破壁的溶液同时测酶活（奈斯勒试剂显色法：1ml0.04M的天冬酰胺底物加1ml0.02MpH=8的磷酸盐缓冲液，37度水浴5min预热后，加入粗酶液500ul37度反应15min后，加入1ml50%的三氯乙酸终止反应。再从终止管里取500ul加到3.5ml蒸馏水中，加入1ml奈斯勒试剂显色15min，500nm处测OD值），结果值很低；在测OD值之前我将浑浊的反应液都离心过了，加入奈斯勒试剂后明明看到颜色变得深黄，然后测OD值时却显示很低，实在不知道原因。请各位高手给点建议~~~谢谢 |
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【答案】应助回帖
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只说酶活测定方法，我个人的理解： 1. 粗酶液里面有没有含氮有机物啊，菇凉你有木有做空白对照啊(是酶样自己的空白对照，不是标准品的对照)，就是先加三氯乙酸，然后水浴15min，水浴结束后再加粗酶液。 2. 标准品对照问题，硫酸铵标准品浓度多少，A500多少？与酶样A500相比怎么样？ 3. 酶活定义问题，菇凉你是如何定义酶活的 (比如可以定义1min生成1μmole氨定义为1U)？理论上根据硫酸氨标准品浓度和门冬酰胺酶反应时间， 可以计算出硫酸铵标准品代表多少酶活的，这样才能计算你粗酶液的酶活，粗酶液A500低不代表酶活低 4. 奈斯勒试剂是自己配的还是买的碘化汞钾？建议你在测定时候看看A500稳定不稳定，如果用碘化汞钾的话，读数有可能是不太稳定的。 这个是中国药典里面的门冬酰胺酶酶活测定方法： http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6333558&fpage=1 |
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4楼2013-12-10 19:51:27
