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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » NI 柱纯化重组蛋白无法洗脱是什么原因？
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zhangjie_924

新虫 (小有名气)

[求助] NI 柱纯化重组蛋白无法洗脱是什么原因？ 已有4人参与

最近一直在做重组蛋白的纯化，8M盐酸胍（PBS稀释）变性，室温平衡40min,与NI柱结合1h ,灌柱，复性，梯度洗脱
，但跑不出想要的峰值，接收不到纯化的蛋白，后续又对盐酸胍变性液和NI柱WB检测，发现我的目的蛋白主要都在NI柱子上，而且出现重组聚集状态，在这里求助高手，如何解决蛋白结合ni柱，无法洗脱的问题，再有，蛋白聚集的原因是什么，如何解决，蛋白聚集是否是无洗脱的原因？谢谢啦
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1楼 2014-06-10 09:25:44
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lpzl

木虫 (正式写手)
具体洗脱步骤？？？
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Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2014-06-10 09:36:53
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zhangjie_924

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lpzl at 2014-06-10 09:36:53
具体洗脱步骤？？？

到处都是洗脱方法，我只关心我想知道的，蛋白聚集是什么原因，无法洗脱的原因有哪些？
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3楼2014-06-10 09:40:05
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Davie_Meagen

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
复性失败导致蛋白聚集，
聚集的蛋白不溶于PBS溶液，
只能用8M盐酸胍洗脱下来，
不然你的Ni柱也没法再用了。
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4楼2014-06-10 15:51:03
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会思想的芦苇

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么用PBS稀释  蛋白沉在柱子上啦  要全程变性条件
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5楼2014-06-10 16:46:00
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
降低pH值试试看，到6.8，不行，到6.5， 同时加入咪唑。
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行至水穷处，坐看云起时
6楼2014-06-10 18:04:46
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zhangjie_924

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 会思想的芦苇 at 2014-06-10 16:46:00
为什么用PBS稀释  蛋白沉在柱子上啦  要全程变性条件

全程变性条件是什么意思？谢谢谢
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7楼2014-06-11 12:27:11
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zhangjie_924

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by pennchem at 2014-06-10 18:04:46
降低pH值试试看，到6.8，不行，到6.5， 同时加入咪唑。

我的洗脱液是PH=5.8 0.5M的咪唑，您说的PH和咪唑是指哪部分？谢谢谢
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8楼2014-06-11 12:28:31
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zhangjie_924

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Davie_Meagen at 2014-06-10 15:51:03
复性失败导致蛋白聚集，
聚集的蛋白不溶于PBS溶液，
只能用8M盐酸胍洗脱下来，
不然你的Ni柱也没法再用了。

您说的8M的盐酸胍是用纯水稀释的吗？
复性失败的原因可能有哪些呢？非常感谢
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9楼2014-06-11 12:31:11
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YangKang7057

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangjie_924: 金币+5 2014-12-08 11:14:17
变复性的过程中，PH值最好是8.5左右有利于复性，复性过程中蛋白大量聚集可能是变复性失败，不知道你的蛋白中是否含有二硫键，另外，稀释复性最好是8M 6M 4M 2M 1M 最后透析比较好，如果二硫键含量较多，可以选择其他变复性方法
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10楼2014-06-12 14:54:13
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