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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 怪事，粗酶液的活性比纯化出的蛋白活性还要高
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liuyanwisdom

新虫 (初入文坛)

[交流] 怪事，粗酶液的活性比纯化出的蛋白活性还要高 已有6人参与

各位大神，最近小弟在做酶学性质相关的，发现一件怪事，粗酶液中的活性比纯化浓缩的蛋白要高出很多很多，相差了几个数量级了。本人在纯化的时候使用的His-tag，用Ni柱跑的，250mM咪唑洗脱，然后用超滤去除咪唑。整个过程都是在4度下进行的，而且保存纯酶的buffer中加不加EDTA经测试活性类似。大神们有遇到类似的情况的吗？
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1楼 2014-04-26 21:31:47
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
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抱歉！昨天我说反了，。有时候想着别的事情，回答的内容和想的不一样。

我离开忘了下线。刚上来。

我遇到过你这样的情况，是因为在纯化过程中，有些激活目标蛋白的其他的离子、小分子或者蛋白质被纯化掉了，也就是激活因子在纯过程化中被去掉了。因为这些有机或者无机因子存在时直接影响了目的蛋白质的空间构象或者形成了某种溶液中的多酶复合体，因此能够加大酶的活性。
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4楼2014-04-27 09:58:05
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普通回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这是正常的事情，因为纯化时去掉了原来的天然的酶的抑制剂，酶在天然条件下并不是一定处于最高的活性状态，有学许多时候酶的活性还被有所抑制。
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2楼2014-04-26 22:54:13
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liuyanwisdom

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-04-26 22:54:13
这是正常的事情，因为纯化时去掉了原来的天然的酶的抑制剂，酶在天然条件下并不是一定处于最高的活性状态，有学许多时候酶的活性还被有所抑制。

谢大侠捧场！可是我的酶是粗酶液中的活性比纯酶高啊，怎么去掉抑制剂活性反而下降了呢？我的导师现在也是一头雾水啊。。。

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3楼2014-04-27 00:45:34
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liuyanwisdom

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-04-27 09:58:05
抱歉！昨天我说反了，。有时候想着别的事情，回答的内容和想的不一样。

我离开忘了下线。刚上来。

我遇到过你这样的情况，是因为在纯化过程中，有些激活目标蛋白的其他的离子、小 ...

谢谢大侠！那请问有没有好的解决办法让纯出来的酶活性高一点呢？或者有没有相关的文献推荐阅读的呢？就快到deadline了，小弟也是想尽可能的让纯酶活性高一点啊……小弟是新人，能得到大侠的帮助真的很开心啊！最后再谢过大侠！

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5楼2014-04-27 10:35:28
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
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提高蛋白质的活性在体外大概只能够从改变溶液环境和固定化两个角度入手，多酶体系的构成除非能够检测出其在细胞内的构成（要是直接用蛋白质的协同性实验或者protein-protein interaction实验，即使是体外实验工作量也比较大，不太现实）。
多酶体系和酶的协同性的书籍不是很多，你可以查阅：
1.Jo M.Holt edits ,Methods in Enzymology Volume 380-Energetics of Biological Macromolecules(Part E),Acaemic Press,2004.
2.Peter Friedich edits,Supermolecular Enzyme Organization,Pergmon Press,1984.
可以用Key words:regulation of enzyme,activity到SCI文献中直接搜索文献。王镜岩的生物化学2002年高教出版社第三版（上册）酶的调节那部分也写了少量这方面内容。

我不是大侠。
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6楼2014-04-27 10:55:34
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liuyanwisdom

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-04-27 10:55:34
提高蛋白质的活性在体外大概只能够从改变溶液环境和固定化两个角度入手，多酶体系的构成除非能够检测出其在细胞内的构成（要是直接用蛋白质的协同性实验或者protein-protein interaction实验，即使是体外实验工作量 ...

是大侠！谢谢指导！👍

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7楼2014-04-27 11:08:34
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pennchem

专家顾问 (正式写手)
★
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确信你在纯化过程中酶没有变性？
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行至水穷处，坐看云起时
8楼2014-04-27 19:32:08
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liuyanwisdom

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by pennchem at 2014-04-27 19:32:08
确信你在纯化过程中酶没有变性？

我的酶是包涵体经过变性然后复性得到的，经过活性测试和从上清里纯出来的差不多。操作过程应该没什么问题，难道是有什么地方忽略导致变性了，大侠认为哪些地方容易导致变性呢？我新手，对这方面也没什么经验……

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9楼2014-04-27 22:50:36
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zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)
★
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穿透测一下酶活力，纯化前和纯化后混合再测下有没提高

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关注我关注的
10楼2014-04-27 23:23:45
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