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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助QPCR扩增效率的影响因素
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

[求助] 求助QPCR扩增效率的影响因素

各位大侠，小弟在做QPCR（SYBR），在验证引物可用性的时候
        1.使用的模板是普通PCR产物的模板（做的原核生物，为了节约CDNA）2 UL,按照10倍梯度稀释
              2.引物浓度时200MM
              3.退火温度是57.5℃
              4.扩增条件：95℃ 30 S (1 CYCLE), 95℃ 5S（40 CYCLES） ,57.5℃ 31 S  20UL 体系
               结果：溶解曲线是单峰，但是扩增效率太高了，有的基因达到200%，
        我想求教大侠：在不换引物的前提下：1.使用PCR产物模板，是否模板浓度太高会使得扩增效率降低？
                                          2.退火温度提高了，是否会使得扩增效率降低？@西瓜  @biostar2009 @孙启亮 @cicelyzh
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生命不息奋斗不止
1楼2014-08-12 19:31:24
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vapordw

新虫 (初入文坛)
单峰 效率到200%- -这个我也学习一下为啥。。。
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2楼2014-08-18 16:18:09
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by vapordw at 2014-08-18 16:18:09
单峰 效率到200%- -这个我也学习一下为啥。。。

模板稀释不准 以及 CDNA浓度问题 浓度太高会影响扩增效率 以前看别人帖子提过  自己后来按照2倍稀释后 扩增效率在95-100.01之间 经验共享 希望对你有帮助
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生命不息奋斗不止
3楼2014-08-19 00:14:39
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yangxy04

金虫 (小有名气)
扩增效率200%！！！题主要考虑是否在模板稀释过程中出现问题，是否存在高浓度样品污染低浓度样品的情况。具体的要看了你的扩增曲线、溶解曲线以及标准曲线的结果才能判断。
其次题主提到的两个问题
1、模板浓度过高会抑制PCR反应，可能会导致扩增效率降低。但同时可能会出现非特异性扩增导致结果的Ct值不可信，最终导致扩增效率不可信。
2、在一定范围内提高退火温度不会太影响扩增效率。
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冷雁孤旅
4楼2014-08-20 16:47:07
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by yangxy04 at 2014-08-20 16:47:07
扩增效率200%！！！题主要考虑是否在模板稀释过程中出现问题，是否存在高浓度样品污染低浓度样品的情况。具体的要看了你的扩增曲线、溶解曲线以及标准曲线的结果才能判断。
其次题主提到的两个问题
1、模板浓度过 ...

哦   受教了 没有金币  送一朵花吧 非常感谢
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生命不息奋斗不止
5楼2014-08-20 17:18:05
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小璜大侠

新虫 (初入文坛)
哥们，我遇到一样的问题，也是pcr产物模板，在高拷贝数的时候，扩增效率很好，接近1，但是在低浓度的时候，扩增效率很高，也就是低浓度的时时候，ct值随着稀释倍数的变化不够，请问你后面是怎么解决的，多谢！
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6楼2015-08-26 08:58:00
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zhou阳阳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小璜大侠 at 2015-08-26 08:58:00
哥们，我遇到一样的问题，也是pcr产物模板，在高拷贝数的时候，扩增效率很好，接近1，但是在低浓度的时候，扩增效率很高，也就是低浓度的时时候，ct值随着稀释倍数的变化不够，请问你后面是怎么解决的，多谢！

一样遇到此类问题，坐等赐教

[ 发自小木虫客户端 ]
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7楼2015-08-26 15:17:13
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zhou阳阳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2014-08-19 00:14:39
模板稀释不准 以及 CDNA浓度问题 浓度太高会影响扩增效率 以前看别人帖子提过  自己后来按照2倍稀释后 扩增效率在95-100.01之间 经验共享 希望对你有帮助...

那怎么才能保证模版稀释的准确呢？

[ 发自小木虫客户端 ]
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8楼2015-08-26 15:18:40
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhou阳阳 at 2015-08-26 15:18:40
那怎么才能保证模版稀释的准确呢？
...

我是用的easy dillution  (TAKARA)效果非常好
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生命不息奋斗不止
9楼2015-08-27 23:20:38
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小璜大侠 at 2015-08-26 08:58:00
哥们，我遇到一样的问题，也是pcr产物模板，在高拷贝数的时候，扩增效率很好，接近1，但是在低浓度的时候，扩增效率很高，也就是低浓度的时时候，ct值随着稀释倍数的变化不够，请问你后面是怎么解决的，多谢！

明显是没有混合均匀 这个很正常  我买的是easy  dillution（TAKARA）  你去官网查一下 免得我有广告嫌疑
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生命不息奋斗不止
10楼2015-08-27 23:21:46
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