| 查看: 1389 | 回复: 10 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
新手求助~关于克隆的若干问题~ 已有4人参与
|
||
|
最近克隆一个2300bp左右的片段，用的是p-GEMT载体。总是连接不上，不知道是哪里出了问题~ PCR产物胶回收纯化后~ 连接体系：PCR产物 3 ul buffer 5ul 载体 1ul T4连接酶 1ul 4度过夜连接，感受态用的是全是金的trans-t1.全量连接产物加到50ul感受态冰浴半小时，42.4度热激90s，冰浴3分钟，加LB（不含AMP）400u 37度孵育一小时，， l取80ul涂平板，用了蓝白斑筛选，板长的挺好的 但是挑了24个没有一个连接上的~已经做了几次了 不知道是哪里出了问题。。 另外，想问下载体和产物的比例是什么样比较合适~都是按实验室师兄师姐的体系加的不知道比例这回事，， 新手还望大家多多指教 先谢过了。。。 |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有224人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 新手求助关于逆转录PCR问题
已经有9人回复
- 基因克隆求助！！
已经有5人回复
- 关于设计克隆引物时产物片段大小有限制吗，如果我没有全长要怎么做能克隆到它的全长
已经有14人回复
- 菜鸟求助：PCR扩增和扩增产物的克隆？？
已经有9人回复
- 求助分子克隆问题——挑不出阳性克隆！
已经有14人回复
- 求关于Overlap PCR(重叠延伸PCR)的具体实验过程及原理
已经有10人回复
- 肝微粒体体外实验操作细节（新手求教）
已经有20人回复
- 求助-基因克隆及引物设计的问题
已经有6人回复
- 请教各位高人，基因克隆表达的流程是什么？
已经有8人回复
- 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
已经有15人回复
- 求助！关于RT-PCR的问题！
已经有20人回复
- 【求助/交流】急！克隆快做了一个月了，就是做不出来
已经有24人回复
- 【求助/交流】克隆测序问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】请教一个克隆的问题，很棘手！
已经有4人回复
- 【求助/交流】关于基因克隆写文章的问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】克隆转化后菌液PCR无条带
已经有5人回复
- 【求助/交流】基因克隆问题求助！
已经有7人回复
- 【求助/交流】克隆连接时间
已经有18人回复
- 【求助/交流】有关蛋白纯化及其基因克隆的问题！请大家帮助！
已经有10人回复
- 【求助/交流】从RNA到cDNA合成再到克隆PCR的实验技巧和操作细节问题若干，寻求解答
已经有12人回复
6楼2014-07-28 11:14:40
hailey
银虫 (小有名气)
- 应助: 6 (幼儿园)
- 金币: 397.9
- 散金: 20
- 帖子: 185
- 在线: 73.9小时
- 虫号: 1192736
- 注册: 2011-01-19
- 性别: MM
- 专业: 细胞衰老
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-27 19:20:12
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-27 19:20:12
|
我也是新手，前段时间刚做了干扰载体的构建，我就实验过程是这样的 连接体系：PCR产物 2ul dd水 5ul 10*T4 ligase buffer 1ul 载体 1ul T4连接酶 1ul 16度pcr仪过夜连接，感受态用的是全是金的trans-t1.全量连接产物加到感受态(10ul：50ul)冰浴半小时，42度热激60s，迅速冰浴2分钟，加LB（不含AMP）400u 37度孵育2h,然后就涂板，结果很好，然后我又做酶切，测序验证，都没有问题。过程就是这样的，我只是把我的实验记录写下来了，你看看吧，希望对你有帮助。 |
2楼2014-07-27 11:02:43
hailey
银虫 (小有名气)
- 应助: 6 (幼儿园)
- 金币: 397.9
- 散金: 20
- 帖子: 185
- 在线: 73.9小时
- 虫号: 1192736
- 注册: 2011-01-19
- 性别: MM
- 专业: 细胞衰老
3楼2014-07-27 11:05:12
ltfe567
木虫 (正式写手)
- 应助: 18 (小学生)
- 金币: 5456.7
- 红花: 4
- 帖子: 417
- 在线: 778小时
- 虫号: 1427506
- 注册: 2011-10-04
- 性别: GG
- 专业: 中药学其他科学问题
4楼2014-07-27 14:42:18
