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珍藏版怡

银虫 (初入文坛)

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[求助] 新手求助~关于克隆的若干问题~ 已有4人参与

最近克隆一个2300bp左右的片段，用的是p-GEMT载体。总是连接不上，不知道是哪里出了问题~
PCR产物胶回收纯化后~
连接体系：PCR产物 3 ul
               buffer    5ul
            载体       1ul
            T4连接酶 1ul
4度过夜连接，感受态用的是全是金的trans-t1.全量连接产物加到50ul感受态冰浴半小时，42.4度热激90s，冰浴3分钟，加LB（不含AMP）400u  37度孵育一小时，，
l取80ul涂平板，用了蓝白斑筛选，板长的挺好的  但是挑了24个没有一个连接上的~已经做了几次了不知道是哪里出了问题。。
另外，想问下载体和产物的比例是什么样比较合适~都是按实验室师兄师姐的体系加的不知道比例这回事，，
新手还望大家多多指教
先谢过了。。。

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1楼 2014-07-27 10:03:08

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

珍藏版怡

银虫 (初入文坛)

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引用回帖:

3楼: Originally posted by hailey at 2014-07-27 11:05:12
不好意思，这个没有写清楚，，，连接产物与感受态的比例是 10：50 不明白的再交流哈。

那你的目的片段是多大的呢我之前按这个方法做过800bp左右的很好连上不知道现在是什么问题。。

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6楼2014-07-28 11:14:40

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hailey

银虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-27 19:20:12

我也是新手，前段时间刚做了干扰载体的构建，我就实验过程是这样的
               连接体系：PCR产物 2ul
                              dd水    5ul
         10*T4 ligase  buffer    1ul
                              载体    1ul
                           T4连接酶 1ul
16度pcr仪过夜连接，感受态用的是全是金的trans-t1.全量连接产物加到感受态(10ul：50ul)冰浴半小时，42度热激60s，迅速冰浴2分钟，加LB（不含AMP）400u  37度孵育2h,然后就涂板，结果很好，然后我又做酶切，测序验证，都没有问题。过程就是这样的，我只是把我的实验记录写下来了，你看看吧，希望对你有帮助。

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