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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 新手求助~关于克隆的若干问题~
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珍藏版怡

银虫 (初入文坛)

[求助] 新手求助~关于克隆的若干问题~ 已有4人参与

最近克隆一个2300bp左右的片段，用的是p-GEMT载体。总是连接不上，不知道是哪里出了问题~
PCR产物胶回收纯化后~
连接体系：PCR产物 3 ul
                 buffer     5ul
                载体         1ul
                T4连接酶 1ul
4度过夜连接，感受态用的是全是金的trans-t1.全量连接产物加到50ul感受态冰浴半小时，42.4度热激90s，冰浴3分钟，加LB（不含AMP）400u  37度孵育一小时，，
l取80ul涂平板，用了蓝白斑筛选，板长的挺好的  但是挑了24个没有一个连接上的~已经做了几次了 不知道是哪里出了问题。。
另外，想问下载体和产物的比例是什么样比较合适~都是按实验室师兄师姐的体系加的不知道比例这回事，，
新手还望大家多多指教
先谢过了。。。
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1楼 2014-07-27 10:03:08
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hailey

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-27 19:20:12
我也是新手，前段时间刚做了干扰载体的构建，我就实验过程是这样的
                 连接体系：PCR产物   2ul
                                 dd水      5ul
             10*T4 ligase  buffer     1ul
                                 载体      1ul
                               T4连接酶 1ul
16度pcr仪过夜连接，感受态用的是全是金的trans-t1.全量连接产物加到感受态(10ul：50ul)冰浴半小时，42度热激60s，迅速冰浴2分钟，加LB（不含AMP）400u  37度孵育2h,然后就涂板，结果很好，然后我又做酶切，测序验证，都没有问题。过程就是这样的，我只是把我的实验记录写下来了，你看看吧，希望对你有帮助。
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时刻为梦想而战！！
2楼2014-07-27 11:02:43
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hailey

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-07-28 08:44:22
不好意思，这个没有写清楚，，，连接产物与感受态的比例是 10：50    不明白的再交流哈。
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时刻为梦想而战！！
3楼2014-07-27 11:05:12
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ltfe567

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-27 19:20:22
你PCR 用的是什么酶？taq吗，要是别的酶的话查查需不需要加A ，TA克隆的话得有A
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4楼2014-07-27 14:42:18
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体：19.8*载体大小/（1000*载体浓度）ul
片段：99*片段大小/（1000*片段浓度）ul
t4酶： 1
10*T4 buffer  ：   1ul
补水到10ul
16度过夜。      


你的长得很好，没连上是指长的都是p-GEMT原质粒？这样就是没切好载体。
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5楼2014-07-28 11:02:20
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珍藏版怡

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hailey at 2014-07-27 11:05:12
不好意思，这个没有写清楚，，，连接产物与感受态的比例是 10：50    不明白的再交流哈。

那你的目的片段是多大的呢  我之前按这个方法做过800bp左右的 很好连上  不知道现在是什么问题。。
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6楼2014-07-28 11:14:40
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珍藏版怡

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ltfe567 at 2014-07-27 14:42:18
你PCR 用的是什么酶？taq吗，要是别的酶的话查查需不需要加A ，TA克隆的话得有A

这几次我用的是普通的 easy-taq酶~应该不会是这个问题的吧~
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7楼2014-07-28 11:16:42
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珍藏版怡

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-07-28 11:02:20
载体：19.8*载体大小/（1000*载体浓度）ul
片段：99*片段大小/（1000*片段浓度）ul
t4酶： 1
10*T4 buffer  ：   1ul
补水到10ul
16度过夜。      


你的长得很好，没连上是指长的都是p-GEMT原质粒？这样 ...

是的 都是空载~请问没切好载体是什么意思？
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8楼2014-07-28 11:18:31
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 珍藏版怡 at 2014-07-28 11:18:31
是的 都是空载~请问没切好载体是什么意思？...

没切好载体就是载体没有酶切完全。
你现在都是空载，估计是连接没连好。
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9楼2014-07-28 11:21:59
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ltfe567

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 珍藏版怡 at 2014-07-28 11:16:42
这几次我用的是普通的 easy-taq酶~应该不会是这个问题的吧~...

最好咨询下 T载体的试剂公司吧，其实很好连接的，问问他们这个载体适不适合你的PCR 产物
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10楼2014-07-28 11:22:56
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